牛壞死桿菌對(duì)EPH4細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用

汪鋒鋒 ， 蔣 凱 ， 趙鵬宇 ， 王天碩 ， 于思雯 ， 郭東華

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 黑龍江 大慶 163319)

壞死桿菌(Fusobacteriumnecrophorum,Fn)隸屬于擬桿菌科(Fusobacteriaceae)，梭桿菌屬(Fusobacterium)，是嚴(yán)格厭氧、無(wú)鞭毛、無(wú)芽孢和莢膜、多形性的革蘭陰性菌[1]。壞死桿菌存在于多種動(dòng)物和人的口腔、胃腸道以及泌尿生殖道[2]，其中以牛、羊、馬、豬最易感，禽類(lèi)易感性較小，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，小鼠最易感[3]。壞死桿菌對(duì)人的危害常表現(xiàn)為以咽炎、側(cè)頸痛和發(fā)熱為臨床特征的萊米爾綜合征(Lemierre′s syndrome，LS)[4]；對(duì)反芻動(dòng)物而言，最常見(jiàn)的是腐蹄病(Foot rot)，該病在北美洲、南美洲、澳大利亞、新西蘭和歐洲均有報(bào)道[5-6]。國(guó)外奶牛腐蹄病的發(fā)病率為4%～55%，我國(guó)因腐蹄病而淘汰的奶牛占總淘汰奶牛的15%～30%[7]。因壞死桿菌引發(fā)的肝膿腫(Liver abscesses)在不同年齡段的牛只中均有發(fā)生，臨床可導(dǎo)致動(dòng)物采食減少、體重減輕、生產(chǎn)性能降低等[8]。此外，壞死桿菌還可引起奶牛子宮內(nèi)膜炎[9]和乳腺炎[10]，尤其在奶牛產(chǎn)后的短時(shí)間內(nèi)細(xì)菌的豐富度降低，而包含壞死桿菌在內(nèi)的多種致病菌呈現(xiàn)急速增殖，引起乳腺炎。奶牛乳腺炎的發(fā)生不僅會(huì)引起奶牛自身的健康問(wèn)題，也會(huì)影響奶業(yè)的發(fā)展，通過(guò)超基因組焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究乳汁中細(xì)菌DNA的多樣性，發(fā)現(xiàn)壞死桿菌也參與其中[11]。用細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)子宮積膿時(shí)子宮內(nèi)存在的細(xì)菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明壞死桿菌和化膿隱秘桿菌是引起子宮積膿的主要病原[12]。

壞死桿菌具有多種毒力因子[13-14]，其分泌的白細(xì)胞毒素(Leukotoxin,lkt)是重要的毒力因子之一，可以損傷反芻動(dòng)物的中性粒細(xì)胞、肝細(xì)胞、瘤胃上皮細(xì)胞，以及其他的宿主靶細(xì)胞，并且能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抵抗壞死桿菌感染的特異性免疫反應(yīng)[15]。研究表明，壞死桿菌的43K OMP對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞以及倉(cāng)鼠腎細(xì)胞具有黏附作用[16-17]；Narayanan等[18]和郭東華[19]均證實(shí)壞死桿菌的主要毒力因子白細(xì)胞毒素能夠介導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡；汪孫杰[20]驗(yàn)證真核表達(dá)的重組白細(xì)胞毒素可以誘導(dǎo)小鼠肝上皮細(xì)胞的凋亡。但是關(guān)于壞死桿菌感染宿主細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后的具體變化尚不清楚。

本研究以牛壞死桿菌A25菌株為研究對(duì)象，探究其是否參與宿主細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。將壞死桿菌感染小鼠乳腺上皮細(xì)胞系(EPH4細(xì)胞)，分別通過(guò)細(xì)胞增殖和凋亡兩方面試驗(yàn)，探究牛壞死桿菌對(duì)宿主細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在為進(jìn)一步開(kāi)展壞死桿菌在細(xì)胞生長(zhǎng)周期以及凋亡機(jī)制相關(guān)研究和其致病機(jī)制研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清，購(gòu)自Clark bioscience公司；青鏈霉素混合液(100×)雙抗、麥?zhǔn)媳葷峁茉噭┖校?gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒、Beyo ClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒(離心柱式)，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；DL-2 000 Marker、10×Loading Buffer、SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 熒光顯微鏡，德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)賽默飛科技公司產(chǎn)品；厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍公司產(chǎn)品；紫外分析儀，北京君意有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌株、細(xì)胞、培養(yǎng)基 牛壞死桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(A25菌株)Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorum(Fnn)，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC 25286，美國(guó))；A25菌株和EPH4細(xì)胞，均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)獸醫(yī)分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。腦心浸液瓊脂(BHI)、厭氧培養(yǎng)液，均購(gòu)自Hopebiol公司(青島海博)；DMEM高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)分組 EPH4細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、100 U/L青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d消化傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，對(duì)照組為未進(jìn)行任何處理的EPH4細(xì)胞，試驗(yàn)組為壞死桿菌處理的EPH4細(xì)胞。

1.4.2 壞死桿菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù) 從-80 ℃取出1管壞死桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株A25(甘油與細(xì)菌1∶9凍存)，接種于5 mL厭氧培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)3次，培養(yǎng)于溫度為37 ℃，氣體壞境為85% N2、10% H2、5% CO2的厭氧箱中，復(fù)壯后的細(xì)菌按照1∶20的比例接種于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)麥?zhǔn)媳葷峁茉噭┖姓f(shuō)明書(shū)，使用紫外分析儀測(cè)定培養(yǎng)細(xì)菌的OD600值，與已知OD600值相比較，計(jì)算細(xì)菌濃度，見(jiàn)表1。

表1 麥?zhǔn)媳葷岱?/p>

1.4.3 EdU標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖 用細(xì)胞培養(yǎng)液1∶500倍稀釋EdU，使其工作濃度為10 μmol/L，加入到處理后的細(xì)胞中，孵育2 h，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，洗滌液洗滌3次，每次5 min，再加入0.3%的Triton X-100孵育15 min，洗滌液洗滌3次，每次5 min，加入反應(yīng)液避光孵育30 min，洗滌液洗滌3次，每次5 min，加入含DAPI的封片液，隨后通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察并記錄。

1.4.4 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EPH4細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整至濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，加入到6孔板中，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為100感染壞死桿菌2、4 h和6 h，感染結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，加入固定液，10 min后棄去固定液，PBS洗3次，每次3 min，加入Hoechst 33258染色液，染色5 min，棄去染色液，PBS洗3次，每次3 min，滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡觀(guān)察并記錄。

1.4.5 DNA Ladder試驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EPH4細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整至濃度為1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，加入到6孔板中，以MOI為100感染壞死桿菌2、4 h和6 h，按照細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)凋亡基因 收集感染后的EPH4細(xì)胞，TRIzol法提取樣品中的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系：TB GreenPremix12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 1 μL， ddH2O 10.5 μL。引物序列見(jiàn)表2，引物由擎科生物有限公司合成，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表2 凋亡基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 壞死桿菌對(duì)EPH4細(xì)胞增殖的影響 為了研究壞死桿菌對(duì)EPH4細(xì)胞增殖的影響，采用EdU增殖檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞在感染時(shí)間為2、4 h和6 h，MOI為0、50、100、200、500、1 000時(shí)的細(xì)胞增殖率。EdU試驗(yàn)結(jié)果如封二彩版圖1A所示，隨著感染時(shí)間與感染濃度的增加，細(xì)胞增殖逐漸減弱，對(duì)總細(xì)胞數(shù)(見(jiàn)封二彩版圖1B)與EdU的陽(yáng)性細(xì)胞增殖率(見(jiàn)封二彩版圖1C)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在相同感染時(shí)間下，壞死桿菌可顯著抑制EPH4細(xì)胞增殖(P<0.05)。

2.2 壞死桿菌誘導(dǎo)EPH4細(xì)胞凋亡 為了研究壞死桿菌對(duì)EPH4細(xì)胞凋亡的影響，壞死桿菌按照MOI為100感染EPH4細(xì)胞2、4 h和6 h，通過(guò)Hoechst 33258染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段化。Hoechst 33258染色后，活細(xì)胞為正常藍(lán)色的圓形或橢圓形，而凋亡細(xì)胞因染色質(zhì)固縮，其細(xì)胞核呈致密濃染，顏色為亮藍(lán)色。與對(duì)照組相比，隨著感染時(shí)間的增加，試驗(yàn)組EPH4細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的亮藍(lán)色熒光，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性(圖2A)。壞死桿菌感染后提取EPH4細(xì)胞的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與對(duì)照組相比，壞死桿菌感染細(xì)胞2、4 h和6 h后，分別出現(xiàn)不同程度的DNA“梯狀”條帶(圖2B)，表明壞死桿菌可誘導(dǎo)EPH4細(xì)胞凋亡。

圖2 壞死桿菌對(duì)EPH4細(xì)胞凋亡的影響

2.3 RT-qPCR檢測(cè)壞死桿菌感染EPH4細(xì)胞后凋亡基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量 將EPH4細(xì)胞接種于6孔板中，壞死桿菌按照MOI為100感染EPH4細(xì)胞，分別在感染2、4 h和6 h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后RT-qPCR檢測(cè)凋亡基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，壞死桿菌感染2 h和4 h時(shí)，促凋亡基因Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.001)，抑凋亡基因Bcl-2的mRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，Bax與Bcl-2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量的比值也顯著性上調(diào)(P<0.05)；而壞死桿菌感染6 h時(shí)，促凋亡基因Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.001)，抑凋亡基因Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.001)，Bax與Bcl-2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量的比值顯著性下調(diào)(P<0.001)(圖3A～3C)。與對(duì)照組相比，壞死桿菌感染細(xì)胞2 h和4 h時(shí)后，促凋亡基因AIF的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.001)，在感染6 h時(shí)，其mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.001)。與對(duì)照組相比，壞死桿菌感染細(xì)胞2 h時(shí)，Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，而感染4 h和6 h時(shí)，其mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.001)(圖3D～3F)。結(jié)果表明壞死桿菌感染細(xì)胞后，可引發(fā)細(xì)胞凋亡，該結(jié)果與Hoechst 33258染色和DNA Ladder試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 RT-qPCR檢測(cè)凋亡基因的mRNA表達(dá)水平

3 討論

壞死桿菌是一種多形性桿菌，革蘭染色呈陰性，病灶內(nèi)細(xì)菌鏡檢呈長(zhǎng)絲狀，著色不均勻，臨床引起以壞死性和化膿性感染為主要特征的壞死桿菌病。隨著對(duì)壞死桿菌的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)壞死桿菌作為機(jī)會(huì)性病原體參與人和動(dòng)物的壞死性和化膿性疾病，例如動(dòng)物的腐蹄病、肝膿腫、乳腺炎和人的Lemierre′s綜合征[21]等。壞死桿菌的毒力因子主要有白細(xì)胞毒素、溶血素、內(nèi)毒素、外膜蛋白、皮膚壞死毒素等，大量研究表明這些毒力因子在病原菌黏附宿主細(xì)胞、病原菌與宿主細(xì)胞相互作用并大量繁殖、病原菌產(chǎn)物導(dǎo)致宿主細(xì)胞損傷或死亡等方面起到重要作用[17-21]，但壞死桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究甚少。

因此，本研究首先通過(guò)壞死桿菌A25菌株感染鼠乳腺上皮細(xì)胞，采用EdU增殖試驗(yàn)檢測(cè)壞死桿菌在不同感染復(fù)數(shù)和不同感染時(shí)間條件下對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，壞死桿菌以時(shí)間與濃度依賴(lài)性抑制鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖。細(xì)菌感染后，可以通過(guò)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞或上皮細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)菌感染，細(xì)胞凋亡通常不會(huì)引起炎癥反應(yīng)[22]，因此其是細(xì)菌感染的首選途徑，此外，細(xì)菌感染后，還可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)自身的感染與增殖[23]。壞死桿菌同樣可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)濃縮，形成凋亡小體，DNA斷裂形成180 bp 大小的片段，電泳時(shí)形成“Ladder”條帶[24]，在壞死桿菌感染EPH4細(xì)胞后，Hoechst染色觀(guān)察到凋亡小體的出現(xiàn)，核酸電泳DNA呈現(xiàn)“Ladder”條帶。

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，不僅呈現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)上的變化，在基因水平上也會(huì)發(fā)生變化，因此，本研究在mRNA水平上進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞凋亡的發(fā)生，RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，壞死桿菌感染EPH4細(xì)胞2 h時(shí)，促凋亡基因Bax和Bax/Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；感染4 h時(shí)，促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)；感染6 h時(shí)，促凋亡基因AIF的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線(xiàn)粒體膜上的Bcl-2家族的促凋亡基因在死亡刺激信號(hào)下，調(diào)控線(xiàn)粒體膜的通透性，從而釋放AIF等促凋亡因子，在促凋亡因子的作用下，募集Pro-caspase-9，從而激活Caspase-3，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[25]。而對(duì)于在感染后期抑凋亡基因Bcl-2的上調(diào)以及Bax/Bcl-2的下調(diào)，出現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，可能是由于感染時(shí)間增加，細(xì)胞死亡方式偏向細(xì)胞壞死[26]，這也與DNA Ladder和Hoechst染色結(jié)果一致。本研究證明了牛壞死桿菌能夠抑制EPH4細(xì)胞增殖且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為壞死桿菌致病機(jī)制的研究提供了一定的理論依據(jù)。