中藥調控阿爾茨海默病tau蛋白過度磷酸化的研究進展

周 君，李明成，米彩云，王虎平

甘肅中醫藥大學 甘肅省中醫方藥挖掘與創新轉化重點實驗室，蘭州 730000

目前全球人口格局呈現老齡化發展態勢，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的患病率逐年攀升，30年后全球老年癡呆患者總量將高達1.38億，其中絕大多數為AD患者[1]。受當前新型冠狀病毒疫情的影響，AD患者的護工數量銳減[2]，加劇了龐大的AD患者群體對個人，家庭，乃至整個社會的壓力。AD的起病及病程演變尚不可控，進行性情感和認知障礙及記憶力衰退是其顯著的臨床表現。tau蛋白過度磷酸化是導致神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NTFs)的主要因素，而NFTs正是AD的主要病理特征[3]。tau蛋白是一種微管相關蛋白，tau蛋白與微管結合后可保障微管結構的穩定[4]，從而維持微管的生理功能。位于tau蛋白上的蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)稱為可磷酸化位點，在激酶的作用下發生磷酸化[5]，形成磷酸化tau蛋白；磷酸化tau蛋白與已結合的微管發生解離，導致微管穩定性降低進而引發細胞骨架坍塌，解離下來的磷酸化tau蛋白形成雙螺旋結構后形成NFTs；磷酸酶可去除磷酸化tau蛋白上的磷酸基團，恢復tau蛋白的生理功能(見圖1)。總而言之，tau蛋白磷酸化水平有賴于激酶與磷酸酶的共同調控[6]。

圖1 tau蛋白受激酶和磷酸酶的調控示意圖

AD在中醫中類屬“癡呆”的范疇，中醫有辨證論治、整體觀念、病證結合等特點，運用中藥在防治AD方面具有獨到優勢。據現有臨床和動物研究表明，中藥防治AD有多途徑抑制tau蛋白過度磷酸化的優勢(如表1、2所示)，如中藥通過調控激酶、磷酸酶的活性，達到降低tau蛋白磷酸化水平，繼而減緩NFTs形成的目的。由此，本文從中藥調控激酶和磷酸酶的角度，探究中藥干預tau蛋白過度磷酸化，防治AD的相關機制。

1 中藥對tau蛋白激酶的調控

1.1 單味中藥對tau蛋白激酶的調控

吳茱萸提取物——吳茱萸次堿干預高糖誘導的AD大鼠后緩解了大鼠的認知障礙，降低GSK-3β的活性，進而降低tau蛋白磷酸化水平[10]。淫羊藿提取物——淫羊藿苷灌胃干預用β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)誘導的AD小鼠后，其認知障礙得到有效改善，海馬區tau蛋白磷酸化現象得到緩解，同時激素膜受體和c-Jun水平也受到調控[11]；用淫羊藿苷預處理后誘導細胞損傷的實驗認為其可通過調控磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/GSK-3β信號通路，降低tau蛋白磷酸化水平[12]，淫羊藿苷有一定抗AD的功效。五味子提取物——北五味子酸性多糖(acidic polysaccharose of schisandrae chinensis，SCP-A)灌胃干預Aβ25-35誘導的AD小鼠后，測得GSK-3β活性減弱，削弱其對tau蛋白的磷酸化力度，此外小鼠的認知功能也得到改善[13]。采取腹腔注射D-半乳糖聯合雙側海馬注射Aβ25-35的方式建立AD模型大鼠后，用不同劑量的黃連素(黃連提取物)對其灌胃，發現黃連素劑量在150 mg/kg時對AD大鼠的GSK-3β和磷酸化tau蛋白表達的下調作用最強[14]，另一項對APP/PS1雙轉基因小鼠進行黃連素灌胃的研究表明，黃連素可抑制核轉錄因子(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路，緩解tau蛋白過度磷酸化，減輕小鼠的認知障礙，抑制神經炎癥[15]。Yang等[16]用人參皂苷Rb1溶液培養Aβ1-42誘導的AD模型小鼠腦片，結果顯示人參皂苷Rb1能夠下調因造模引起的tau蛋白過度磷酸化水平，并通過抑制激酶ERK1/2的活性來減少NFTs的形成。Xiong等[17]認為荔枝核的有效成分可通過調控胰島素受體基因-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)/PI3K/Akt/GSK-3β信號通路來降低GSK-3β的活性，進而抑制tau蛋白過度磷酸化。芹菜籽提取物——丁苯酞干預由Aβ1-42誘導的AD模型大鼠后，丁苯酞組大鼠形態學表現介于正常組與AD模型組之間，且丁苯酞中、高劑量組的表現優于低劑量組[18]；海馬CA1區GSK-3β活性與磷酸化tau蛋白水平降低[19]；還能改善腦內炎癥及氧化應激反應，改善認知功能[20]。葛根提取物——葛根素干預通過腹腔注射D-半乳糖建立的AD模型大鼠，可削弱因造模引起的GSK-3β強活性與嗅球內tau蛋白的磷酸化[21]。獨活提取物——蛇床子素灌胃APP/PS1雙轉基因小鼠6周后，改善了小鼠學習記憶能力，海馬CA3區錐體細胞和尼氏體數量增多，細胞形態學表現較佳，p-GSK-3β/GSK-3β的表達增高，tau蛋白Ser202位點的磷酸化效應受到削弱，但實驗中未指出p-GSK-3β的檢測位點[22]。Chen等[23]用激活GSK-3β的方式建立AD模型大鼠，建模后用頭頂一顆珠(trillium tschonoskii maxim，TTM)水煎液對AD大鼠進行灌胃干預，實驗結果顯示AD大鼠的學習記憶能力得到改善，TTM中、高劑量能改善海馬CA1和CA3區尼氏體的數量與形態，高、中、低劑量均能降低海馬內GSK-3β活性并提高GSK-3β在Ser9位點的磷酸化，還能上調蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Akt活性，抑制tau蛋白磷酸化，改善AD癥狀。知母提取物——知母皂苷干預Aβ1-42誘導的AD大鼠后，大鼠的空間學習記憶障礙得到改善，膽堿乙酰基轉移酶(choline acetyltransferase，ChAT)蛋白表達增加，磷酸化Akt增多，促進GSK-3β在Ser9位點磷酸化，達到抑制GSK-3β活性的目的，進而降低因造模引起的海馬區tau蛋白過度磷酸化，但同時發現GSK-3β的表達增多[24]。丹參酮IIA是中藥材丹參的脂溶性有效成分，Lin等[8]在注射Aβ1-42建立AD模型大鼠時，發現Aβ1-42具有促進GSK-3β在Tyr216位點磷酸化，并抑制GSK-3β在Ser9位點磷酸化的作用；建模后用丹參酮IIA對AD大鼠進行灌胃干預，實驗結果表明丹參酮IIA可逆轉由造模引起的學習記憶障礙，可改善腦內細胞形態，且海馬區tau蛋白磷酸化程度與丹參酮IIA劑量具有相關性，此外GSK-3β在Ser9位點磷酸化水平升高，Tyr216位點磷酸化水平降低，伴磷酸化ERK增多，tau蛋白的磷酸化水平降低。

1.2 復方對tau蛋白激酶的調控

黃連解毒湯(黃連、黃芩、黃柏、梔子)灌胃干預由Aβ25-35誘導的AD模型大鼠，發現其可改善AD大鼠的學習能力[25]，抑制GSK-3β和CDK-5的活性，還可對tau蛋白多個位點的磷酸化進行干預[26]，進而起到防治AD的作用。雙側海馬注射Aβ25-35建立AD模型大鼠后，用不同劑量的烏芩健腦方藥液(制首烏、郁金、黃芪、川芎等)對其實施干預，實驗發現該藥液可改善AD大鼠的學習記憶能力，能通過弱化CDK5與GSK-3β活性從而減輕tau蛋白過度磷酸化程度[27]。復智散干預Wistar大鼠皮層神經元，采取Aβ25-35養的方式建立AD模型，發現復智散可弱化CDK5活性，同時可在多個位點抑制tau蛋白的磷酸化，實驗結果提示調控calpain-p25/CDK5通路進而抑制tau蛋白過度磷酸化或許是復智散抑制tau蛋白過度磷酸化的主要途徑[28]。Guo等[29]對兩種AD模型小鼠(東莨菪堿腹腔注射小鼠和認知障礙與年齡相關的SAMP8小鼠)展開好忘方(續斷、肉蓯蓉、茯苓、遠志、菖蒲)與鹽酸多奈哌齊的隨機對照試驗，實驗結果表明，好忘方可改善AD小鼠的認知障礙，減少記憶丟失，并對PKA/GSK-3β/tau信號通路進行調控，抑制tau蛋白的磷酸化，緩解腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的下降趨勢，增強突觸的可塑性。益智聰明湯(人參、肉蓯蓉、赤芍、知母、菖蒲等)干預由Aβ25-35誘導的AD模型小鼠，發現小鼠學習記憶障礙得到改善，海馬區細胞形態結構較佳，益智聰明湯中、高劑量組抑制tau蛋白的Ser404和Thr231位點磷酸化效果最明顯，高劑量組還對tau蛋白的Thr181和Ser396位點的磷酸化有抑制作用，同時強化PI3K在p85位點、Akt在Ser473位點與GSK-3β在Ser9位點磷酸化的表達[30-32]。表明益智聰明湯可通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路對tau蛋白的磷酸化進行調控，繼而防治AD。

2 中藥對tau蛋白磷酸酶的調控

磷酸酶活性降低時，脫磷酸效應隨之降低，這將無法扭轉磷酸化tau蛋白逐步增多的局面，最終導致tau蛋白過度磷酸化。中藥可通過調控磷酸酶的活性達到防治AD的目的，在眾多的磷酸酶中，蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的脫磷酸效應強度占總脫磷酸效應的大多數[33]，因此PP2A常作為檢測磷酸酶效應的指標。

2.1 單味中藥對tau蛋白磷酸酶的調控

板橋黨參干預岡田酸誘導的AD模型大鼠，實驗結果顯示板橋黨參可提升PP2A活性，降低tau蛋白磷酸化水平，修復神經元損傷[34]。TTM水煎液干預岡田酸誘導的AD大鼠后，AD大鼠的空間學習能力得到改善，且海馬內PP2A活性上升，tau蛋白磷酸化水平降低，其中TTM高劑量組的尼氏體含量顯著增加[35]。人參提取物——人參皂苷Rb1干預岡田酸誘導的AD模型大鼠，檢測海馬后發現PP2A活性明顯提高，且tau蛋白磷酸化水平下降，神經元形態結構得到改善[36]。山茱萸提取物——山茱萸環烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside，CIG)干預tau蛋白過表達的rTg4510轉基因AD小鼠，3個月后發現小鼠的認知及記憶力得到改善，對小鼠大腦進行檢測后發現CIG增強了PP2A活性，降低tau蛋白過度磷酸化程度和聚集程度[37]。

2.2 復方對tau蛋白磷酸酶的調控

扶正祛邪方(人參、川芎、黃連)灌胃處理SAMP8小鼠，實驗結果表明該方可維持海馬CA1區內神經元總量變化，提高PP2A活性，抑制tau蛋白過度磷酸化，改善學習記憶能力[38]。柴胡疏肝散(柴胡、枳殼、香附、川芎、白芍、陳皮、甘草)干預通過腹腔注射D-半乳糖聯合雙側海馬注射Aβ1-42建立的AD模型大鼠，發現柴胡疏肝散可增加PP2A的表達，逆轉由造模引起的tau蛋白過度磷酸化狀態，改善AD大鼠的認知和學習障礙[39]。

3 中藥對tau蛋白激酶和磷酸酶的共同調控

tau蛋白過度磷酸化導致的NFTs是AD的主要病理特征之一[3]，用于描述AD患者腦內神經元受損程度。激酶和磷酸酶的活性變化在tau蛋白過度磷酸化的進程中起關鍵性作用，當激酶對tau蛋白的磷酸化效應與磷酸酶對磷酸化tau蛋白的脫磷酸效應的平衡被打破，在磷酸化效應明顯強于脫磷酸化效應時呈現出tau蛋白過度磷酸化的態勢。目前研究表明，中藥防治AD的優勢在于可通過多條途徑干預tau蛋白的磷酸化進程。

3.1 單味中藥對tau蛋白激酶和磷酸酶的共同調控

目前研究認為鋅是導致AD的誘因之一，鋅可活化p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)和GSK-3β[40]，間接提高tau蛋白磷酸化水平。一項研究用鋅誘導tau蛋白特定位點(Ser262)磷酸化后加以銀杏提取物(Ginkgobilobaextract 761，EGB761)進行處理，結果顯示EGB761能夠防止p38MAPK和GSK-3β被鋅誘導活化，表明GBE761具有在Ser262特定位點抑制tau蛋白磷酸化的能力[41]。Zeng等[42]采用高同型半胱氨酸血癥模擬AD模型大鼠后使用EGB761，發現EGB761能夠糾正PP2A與GSK-3β的活性，還原磷酸化tau蛋白特定位點的未磷酸化狀態。由此可知銀杏葉有調控激酶與磷酸酶的能力，可抑制tau蛋白的磷酸化。CIG干預rTg4510轉基因小鼠，實驗結果表明CIG可減少病理性tau蛋白的異常沉積，還可通過上調內源性PP2A激活劑(phosphatase 2A phosphatase activator，PTPA)的表達，進而增強PP2A的活性，改善tau蛋白過度磷酸化現象[43]。山茱萸提取物——山茱萸多糖干預采取腹腔注射D-半乳糖聯合雙側海馬注射Aβ1-40建立AD模型大鼠后，GSK-3β表達受到抑制，即山茱萸多糖通過弱化激酶的磷酸化效應來緩解tau蛋白過度磷酸化狀態[44]。黃芪提取物——黃芪多糖灌胃干預Aβ25-35誘導的AD大鼠后，大鼠定位與學習能力有所改善，且PP2A水平上升，Aβ、磷酸化tau蛋白、GSK-3β和β-分泌酶(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme，BACE1)水平降低[45]。另一項研究表明黃芪多糖能將tau蛋白磷酸化水平和GSK-3β活性降低，且黃芪多糖能激活Wnt通路從而抑制Aβ引起的神經毒性[46]。何首烏提取物——二苯乙烯苷灌胃干預APP/PS1/tau三轉基因小鼠后小鼠學習記憶能力得到改善，GSK-3β和JNK活性降低，PP2A蛋白與蛋白磷酸酶2B(protein phosphatase 2B，PP2B)mRNA的轉錄及其蛋白表達升高，腦組織中磷酸化tau蛋白在Ser404和Thr205位點的表達下降、聚集度降低、分布范圍縮小，認為二苯乙烯苷可通過削弱GSK-3β和JNK對tau蛋白的磷酸化效應，增強PP2B的脫磷酸效應來緩解tau蛋白磷酸化的效應[47-49]。單味中藥及其提取物對AD中tau蛋白過度磷酸化的調控見表1。

表1 單味中藥及其提取物對AD中tau蛋白過度磷酸化的調控

3.2 復方對tau蛋白激酶和磷酸酶的共同調控

復方金思維干預雙側腦室注射微量鏈脲佐菌素建立的AD模型大鼠后，進行免疫組化染色觀察GSK-3β、蛋白磷酸酶1(protein phosphatase1，PP1)、PP2A，結果顯示金思維能調控GSK-3β、PP1、PP2A活性，使之保持在正常范圍，進而使tau蛋白磷酸化維持在正常水平[50]。不同劑量的遠志散(遠志、枳殼、旋覆花、半夏等)灌胃Aβ1-40誘導的AD模型大鼠，實驗表明遠志散可通過調節PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制AD大鼠海馬CA1區tau蛋白磷酸化表達[51]；Li等[52]利用遠志散干預Aβ1-40誘導的AD模型大鼠后，檢測發現海馬區PP2A活性增強，GSK-3β活性減弱，在激酶與磷酸酶效應力的綜合作用下，tau蛋白過度磷酸化程度降低。滌痰湯對岡田酸誘導的AD大鼠進行灌胃，實驗表明其能降低tau蛋白Ser214、Ser262位點的過度磷酸化，這可能與上調PP2A活性，增強對磷酸化tau蛋白的脫磷酸效應有關[53]。證明滌痰湯可有效緩解AD大鼠臨床癥狀后，對滌痰湯及其拆方繼續展開研究，研究表明滌痰湯拆方和全方能夠通過上調PP2A、下調GSK-3β活性，進而降低tau蛋白磷酸化水平，并緩解AD大鼠的空間學習障礙[54]。黃精丸灌胃干預采用D-半乳糖聯合岡田酸誘導的AD模型小鼠后，小鼠學習記憶障礙得到改善，這可能與激活Wnt/catenin信號通路有關[55]；海馬CA1和CA3區神經元數量、PP2A蛋白及mRNA表達增強，且CA1區GSK-3β在Ser9位點磷酸化增強，削弱其對tau蛋白的磷酸化效應[56]。酸棗仁湯(酸棗仁、茯苓、川芎、知母、炙甘草)灌胃干預APP/PS1雙轉基因小鼠，發現酸棗仁湯可有效改善小鼠學習記憶力，海馬CA3區神經與尼氏體數量較多，細胞排列密集，神經元樹突棘密度與分支數量均優于模型組，GSK-3β表達減弱，GSK-3β的Ser9位點磷酸化后GSK-3β失活，tau蛋白磷酸化程度降低[57]。表明酸棗仁湯可從直接削弱GSK-3β表達與對其Ser9位點磷酸化這兩種直接與間接的方式削弱其對tau蛋白的磷酸化效應，達到防治AD的目的。溫脾通絡開竅湯(黃芪、益智仁、何首烏、三七、絞股藍、石菖蒲)干預右側海馬注射岡田酸的AD模型大鼠三周，海馬檢測顯示溫脾通絡開竅湯中、高劑量組GSK-3β活性降低，PP2A活性增高，且與中藥劑量組之間存在量效關系[58]；溫脾通絡開竅湯中、高劑量組海馬tau蛋白磷酸化水平降低，大鼠認知障礙得到緩解[59]，即溫脾通絡開竅湯從GSK-3β和PP2A兩個角度降低tau蛋白過度磷酸化。復方對AD的tau蛋白過度磷酸化的調控見表2。

表2 復方對AD的tau蛋白過度磷酸化的調控

4 總結及展望

盡管目前尚未找到成熟的方式來干預AD的發病及病情進展，大量中藥的臨床、動物及細胞實驗已證實中藥在干預阿爾茨海默病tau蛋白過度磷酸化方面有一定效果[60]。中醫認為AD病位在腦，與心、肝、脾、腎四臟關系密切[61]，在心的統領下，脾運化轉運營養物質，肝調暢機體，腎藏納精微，諸臟配合以保障神機正常發揮。已證實一系列具有補肝腎、益氣活血、補髓益智、清熱解毒等功效的方藥對激酶的調控作用較佳，通過弱化GSK-3β、CDK5、JNK、ERK等激酶活性和調控相應信號通路，抑制tau蛋白相應位點的磷酸化，進而減緩tau蛋白向磷酸化tau蛋白的轉化。盡管現在尚不能詳盡地檢測出磷酸化tau蛋白的磷酸化位點，但已能體現出不同的激酶對tau蛋白磷酸化影響的差異。此外，《血證論》有云：“凡心有瘀血，亦令健忘”認為瘀血是AD的主要致病因素之一，實驗證明具有補氣活血、溫陽化瘀功效的方藥對AD療效較佳，尤其在調控tau蛋白過度磷酸化方面具有一定作用；可直接調控磷酸酶活性，加強對磷酸化tau蛋白的脫磷酸化效應，達到減少產生NFTs，防治AD的目的。更有《石室秘錄》有云：“痰氣最盛，呆氣最深”，清代陳士鐸認為“呆”與“痰”有密切關聯，實驗證實補益肝腎、益氣升陽、活血化瘀、化痰開竅等功效的方藥對激酶和磷酸酶有共同調節作用，由于激酶中GSK-3β的磷酸化效應最強[62]，磷酸酶中PP2A的脫磷酸化效應最強，因此大多數研究以GSK-3β和PP2A為主要檢測目標，來揭示中藥多途徑調控tau蛋白磷酸化的機制。

中藥可通過影響激酶、磷酸酶或同時影響二者等途徑調控tau蛋白的磷酸化水平，達到防治AD的目的。就目前對中藥已開展的研究而言，筆者認為在以下幾方面還有待突破：(1)中藥治療具有辨證論治的特點，在大量實驗中可體現出辨病的過程，但未能充分展現出辨證的特點，可在動物實驗中增加對實驗對象進行辨證的內容；(2)中藥、復方干預AD療效確切，但由于成分復雜，目前作用機制尚未闡明，其推廣可信度較低，可將現代醫學研究技術與中藥防治AD進一步結合，一方面純化并分析中藥起作用的有效成分，另一方面探究中藥藥對調控激酶與磷酸酶的藥對配伍規律，嘗試從分子水平闡釋藥對配伍的意義；(3)多類激酶、磷酸酶呈現網絡狀交互調節tau蛋白的磷酸化水平，但是目前在同一實驗中，由于對激酶和磷酸酶種類與磷酸化tau蛋白的磷酸化位點檢測不全，不足以構建出中藥影響激酶與磷酸酶的全貌，可通過增加檢測激酶和磷酸酶的種類，以及磷酸化tau蛋白的磷酸化位點，找到更充足的證據展現中藥影響激酶與磷酸酶的網絡狀調節系統；(4)部分研究僅對tau蛋白與磷酸化tau蛋白進行定量分析，遺漏對中間環節(激酶、磷酸酶或其他指標)的檢測，造成證據鏈缺失，只能展示結果，不能詳細闡明原因。在后續研究中可適當添加中間證據的檢測，構成完整的證據鏈；(5)大量臨床、動物實驗展現出中藥療效較佳，但是中藥的毒副作用尚不明確，可增加相關中藥的毒理實驗，為中藥的臨床提供更安全的指導。