不同生育期襄麥冬內生細菌的分布及產甾體皂苷菌株的初步篩選

余海忠，程 旭，王海燕，殷幼平，王中康

1湖北文理學院食品科學技術學院，襄陽 441053；2重慶大學生命科學學院，重慶 405200；3襄陽市農業科學院，襄陽 441057

襄麥冬，即湖北麥冬Liriopespicatavar.proliferaY.T.Ma，為《中華人民共和國藥典》(2010年版)山麥冬基源植物之一[1]，甾體皂苷是其主要活性成分，它的皂苷元基本骨架屬于螺甾烷(spirostane，共有27個碳原子組成)的衍生物，依照螺甾烷結構中C25的構型和F環的環合狀態，可將其分為以下四種主要類型：螺甾烷醇類(C25為S構型)、異螺甾烷醇類(C25為R構型)、呋甾烷醇類(F環為開鏈衍生物)、變形螺甾烷醇類(F環為五元四氫呋喃環)。現已從襄麥冬中分離出14種甾體皂苷[2-4]，其主要苷元是薯蕷苷元(diosgenin)和魯斯可苷元(ruscogenin)，均為C25(S)異構體，其中以山麥冬皂苷C(Ls-S3)含量較高[5]。甾體皂苷具有多重藥理學活性[6,7]，除了極少的能化學全合成，主要還是通過化學萃取中藥材直接獲得[8]，襄麥冬甾體皂苷也不例外。但是由于存在生產周期長、大田連作障礙、皂苷含量低、提取成本高、環境污染大等問題[9]，襄麥冬甾體皂苷的可持續生產和供應受到制約，因此，非常有必要尋找大量制備皂苷的新途徑。

此前，有研究報道從滇重樓、華重樓中分離得到可產生甾體皂苷的內生細菌[10-13]，受此啟發，本課題組嘗試從襄麥冬中分離和發掘代謝產生甾體皂苷的內生細菌菌株：利用純培方法和16S rDNA-PCR-DGGE技術[14]，分析和鑒定襄麥冬始見期、迅速膨大期、成熟采收期的樣品(塊根或須根)中內生細菌的分布。同時，采用顏色反應、TLC、HPLC方法，對獲得的純培菌株進行初步的產皂苷能力評價，以期獲得目的菌株為實現甾體皂苷的“工廠化、規模化、快速化”生產提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品處理與表面消毒

襄麥冬樣品分三次采集：2013年9月20日(塊根始見期)、2013年11月28日(塊根迅速膨大期)和2014年3月22日(塊根成熟采收期)，地點位于湖北襄陽歐廟襄麥冬GAP基地。選擇茁壯植株的新鮮塊根或須根，采集后立即帶回實驗室沖洗處理，在無菌條件下，將待處理樣品(塊根、須根)放入75%(V/V)乙醇浸泡2 min，用無菌水漂洗3次；有效氯含量4%～6%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，用大量無菌水連續漂洗4次，并分別設置環境、漂洗和印記對照試驗以檢測表面消毒是否徹底。處理后的樣品用無菌濾紙吸干水分，取一部分在3天之內完成可純培內生細菌的分離操作，另取一部分置-80 ℃保存用于后續16S rDNA PCR-DGGE分析。

1.2 試劑與設備

主要試劑：有效氯含量4%～6%的次氯酸鈉、正丁醇、乙醚、氯仿、濃硫酸、乙酸酐、AlCl3、75%乙醇、無水乙醇、二氨基乙基四乙胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺、色譜純乙腈(上海國藥集團公司)；薄層層析用硅膠G(青島海洋化工廠分廠)；CTAB、SDS、EDTA、TRIS堿、PVP、β-巰基乙醇、葡萄糖、瓊脂、(上海生工)。PCR擴增試劑盒、標準分子量、瓊脂糖、氨卞青霉素、PCR產物純化試劑盒、引物、pMD-19T克隆載體(大連寶生物公司)；細菌基因組DNA小量制備試劑盒、凝膠純化回收試劑盒(Axygen公司)。

主要設備：YSQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊)；HZ-9211K恒溫振蕩器(華利達)；ChemiDoc XPS自動凝膠成像儀(Bio-Rad)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多)；GXP-9160MBE隔水式培養箱(上海博訊)；GZX-9030MBE鼓風干燥箱(上海博訊)；Mastercycler pro梯度PCR儀(Eppendorf)；SIGMA 3K15低溫冷凍離心機(Sigma)；Power Pac HCTM電泳儀(Bio-Rad)；FreeZone 12小型冷凍干燥機(Labconco)；超低溫冰箱(Thermo electron)；MiliQ純水機(Millipore)；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮)；核酸蛋白檢測儀(Beckman)；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀(島津)。

1.3 可純培內生細菌的鑒定

1.3.1 菌株的分離與純化

在無菌條件下，稱取表面消毒樣品組織1.0 g左右，加5 mL無菌水于研缽中充分研磨，將勻漿液按1×10-3倍數稀釋之后，分別吸取0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養基、PDA培養基、LB培養基平板，每個處理設置3個重復，37 ℃避光培養。隨時觀察平板，挑取生長良好的菌落，在牛肉膏蛋白胨培養基平板上作“Z”形劃線，并根據菌落的顏色及形態，分別取呈現不同表形特征的菌落進行多次劃線純化，直至得到單菌落。菌株編號，轉入PDA斜面37 ℃培養，待菌落長滿試管后于4 ℃保藏、待用。

1.3.2 菌株DNA的提取

挑取上述單菌落接種于LB液體培養基中，根據不同菌落生長的特點，在37 ℃下180 r/min分別震蕩培養7～12 h后取菌液2 mL，10 000 r/min離心5 min，去上清收集菌體。采用酶解法[15]提取內生細菌的基因組總DNA，DNA樣品-20 ℃保存、待用。

1.3.3 16S rRNA基因的擴增與克隆

取上述提取的細菌總DNA為模板，以細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增[16]。PCR擴增產物用1%(W/V)的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，用凝膠成像儀檢測。采用pMDTM19-T Vector作為克隆載體，按照KIT提供的操作步驟完成上述PCR擴增產物的連接、轉化和陽性克隆的鑒定。陽性克隆轉接于LB液體培養基，震蕩培養12～16 h后將菌液送出測序。

1.4 內生細菌16S rDNA-DGGE分析

1.4.1 菌株基因組DNA提取

取上述-80 ℃保存的表面消毒樣品，進行內生細菌基因組DNA的提取[16]，洗脫得到的DNA溶解于TE，分裝后-20 ℃保存待用。

1.4.2 菌株16S rDNA V6～V8區的擴增

為了避免植物樣本中線粒體DNA與葉綠體DNA的干擾，本實驗在進行內生細菌16S rDNA序列擴增時分為兩個流程：先按照“1.3.3”項下方法擴增出細菌16S rDNA中的V5～V9高變區；再以V5～V9高變區的擴增產物為模板，采用Nested-PCR[17]來擴增16S rDNA的V6～V8區。擴增結束以后，取一定量的PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否為目的DNA片段，若有，用此PCR產物進行DGGE分析。

1.4.3 PCR-DGGE分離及條帶分析

對上述PCR產物進行濃縮，采用DGGE系統進行電泳分離及條帶分析[16]，依次完成電泳分離、銀染、拍照，使用QuantityOne-1-D軟件標出圖譜中較清晰的條帶，并切下對應的條帶，分別搗碎后加入20 μL ddH2O于-20 ℃過夜，最后以上清液為模板進行PCR擴增和電泳檢測，切割并回收目的DNA條帶，送出測序。

1.5 序列比對

將上述菌株16S rDNA的V5～V9區、V6～V8區序列測序結果，在NCBI數據庫上進行BLAST比對分析，尋找同源性最高的序列進行種屬鑒定。

1.6 產甾體皂苷內生菌株的篩選

1.6.1 菌株發酵液總皂苷提取物的制備

按照“1.3.2”項下方法完成菌株的液體震蕩培養，將發酵液-80 ℃急凍后進行低溫冷凍干燥，再按以下步驟完成菌株發酵液總皂苷的提取：冷凍干燥的發酵產物研成粉末，加入75%乙醇在60 ℃下抽提3 h，重復抽提兩次，合并提取液，旋轉蒸發得浸膏。浸膏加水溶解后，加入乙醚進行萃取，保留水層部分，再加入水飽和正丁醇萃取4次(15、10、5、5 mL)，保留并合并正丁醇層部分。減壓濃縮去除正丁醇后獲得浸膏，即菌株發酵液總皂苷提取物。浸膏根據后續不同的檢測需要，選擇不同的溶劑進行溶解，分裝后于-20 ℃保存待用。

1.6.2 發酵液總皂苷提取物的顏色反應

分別取上述菌株發酵液總皂苷提取物進行顏色反應，初步檢測所提取的菌株發酵產物中是否含有皂苷。如果有，再判斷其是屬于甾體皂苷還是三萜皂苷(見表1)。

表1 內生菌株發酵液總皂苷提取物的顏色反應

1.6.3 發酵液總皂苷提取物的TLC檢測

陽性對照的制備：稱取襄麥冬塊根粉末10 g，加入100 mL甲醇，80 ℃索氏提取3 h至無色，對提取液進行減壓濃縮，得浸膏，后續提取步驟與“1.6.1”項下方法相同，最終獲得襄麥冬總皂苷提取物，用2 mL甲醇溶解，即獲得陽性對照。

TLC檢測：將上述提取的菌株發酵液總皂苷提取物配成甲醇溶液，取10 μL點樣于G型硅膠板上，設置陽性對照。層析液為氯仿-甲醇(100∶1)，顯色液為15%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘3 min，直至顯出清晰紅色斑點為止。

1.6.4 發酵液總皂苷提取物的HPLC檢測

色譜條件：檢測器：SPD-20A；柱溫箱：CTU-10AS 并配有在線脫氣機DGU-20A；色譜柱：Inert Sustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：A水，B乙腈；梯度洗脫(0～25 min，5%B→30%B；25～35 min，30%B→55%B；35～45 min，55%B→65%B；45～55 min，65%B→85%B；55～70 min，85%B→100%B；70～75 min，100%B；75～75.5 min，100%B→5%B；75.5～80 min，5%B)。流速1 mL/min，檢測波長為210 nm，進樣量10 μL，記錄80 min數據，信號強度單位為μV。

2 結果與分析

2.1 可純培襄麥冬內生細菌的分離及鑒定

通過傳統的細菌分離純化方法，本實驗完成對不同生育期襄麥冬塊根和須根的初步分離，獲得50株可純培的內生細菌，其中28株來自須根，22株來自塊根。觀察記錄它們的菌落形態特征，并對其16s rRNA基因進行擴增、測序、BLASTn比對，具體結果見表2。根據菌落形態，并結合序列比對結果，初步表明：上述50株內生細菌分屬15個屬22個種。其中，芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus各分離出4種菌，假單胞菌屬Pseudomonas分離出2種菌，其余的12個屬，包括沙門氏菌屬Salmonella、腸桿菌屬Enterobacter、假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas、摩根菌屬Morganella、農桿菌屬Agrobacterium、微桿菌屬Microbacterium、產卟啉桿菌屬Porphyrobacter、不動桿菌屬Acinetobacter、賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium、短小桿菌屬Curtobacterium，每個屬只有1種菌。

表2 襄麥冬可純培內生細菌的形態特征及其16s RNA基因序列比對結果

上述完成鑒定的22種內生細菌分別為：韋氏芽胞桿菌Bacillusweihenstephanensis(Accession登記號：KC329820)，嗜氣桿菌Bacillusaerophilus(Accession登記號：KC329821)，巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium(Accession登記號：KC329822)，尼爾森桿菌Bacillusnealsonii(Accession登記號：KC329823)，琥珀葡萄球菌琥珀亞種Staphylococcussuccinussubsp.Succinus(Accession登記號：KC329824)，山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae(Accession登記號：KC329825)，溶血性葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus(Accession登記號：KC329826)，表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis(Accession登記號：KC329827)，羅氏假單胞菌Pseudomonasrhodesiae(Accession登記號：KC329817)，極端東方化假單胞菌Pseudomonasextremorientalis(Accession登記號：KC329818)，邦戈爾沙門氏菌Salmonellabongori(Accession登記號：KC329819)，墨西哥假黃單胞菌PseudoxanthomonasMexicana(Accession登記號：KC329828)，根癌土壤桿菌Agrobacteriumtumefaciens(Accession登記號：KC329829)，檸檬色短小桿菌Curtobacteriumcitreum(Accession登記號：KC329830)，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis(Accession登記號：KC329831)，溶血不動桿菌Acinetobacterhaemolyticus(Accession登記號：KC329832)，浮游產卟啉桿菌Porphyrobacterneustonensis(Accession登記號：KC329833)，磚紅色微桿菌Microbacteriumtestaceum(Accession登記號：KC329834)，陰溝腸桿菌Enterobactercloacae(Accession登記號：KC329835)，韓國鞘氨醇單胞菌Sphingomonaskoreensis(Accession登記號：KC329836)，泗陽鞘氨醇桿菌Sphingobacteriumsiyangense(Accession登記號：KC329837)，摩氏摩根菌Morganellamorganii(Accession登記號：KC329838)。

2.2 內生細菌16S rDNA-DGGE圖譜分析

2.2.1 內生細菌 16S rDNA的V5～V9、V6～V8片段的擴增

用通用引物擴增襄麥冬塊根內生細菌16S rDNA V5～V9的4個高變區，得到兩條條帶，分別為730 bp和840 bp(見圖1A)，其中730 bp的條帶為目的片段，進行切膠回收。以上述回收DNA片段為PCR擴增模板，用帶GC夾的968F和1378R，擴增出大小為450 bp的V6～V8的目的片段(見圖1B)。

圖1 襄麥冬內生細菌16S rDNA高變區電泳圖

2.2.2 內生細菌16S rDNA-DGGE圖譜分析

對不同生育期的襄麥冬塊根內生細菌進行DGGE圖譜分析(見圖2)，結果表明：襄麥冬塊根始見期、塊根迅速膨大期和塊根采收期這3個生育期采集的塊根樣品中，內生菌群結構基本相同，細菌類群差異很小。分別將分離的21個區分明顯的條帶割膠回收、測序比對，發現這21個序列分屬15個屬，共計21種不同細菌(見表3)。其中，芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄菌屬Staphylococcus各有3種細菌，沙雷氏菌屬Serratia、假黃單胞菌屬Pseudomonas各有2種，其余的11個屬，包括假單孢屬Pseudomonas、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養單胞菌屬Stenotrophomonas、產卟啉桿菌屬Porphyrobacter、短小桿菌屬Curtobacterium、腸桿菌屬Enterobacter、甲基桿菌屬Methylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、微桿菌屬Microbacterium、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter，均只有1種菌。DGGE所測結果與上述分離得到的22種可純培內生細菌菌株相比，又增加了7個屬：沙雷氏菌屬Serratia、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養單胞菌屬Stenotrophomonas、甲基桿菌屬Methylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter。

表3 DGGE條帶序列比對結果

圖2 襄麥冬內生細菌16S rRNA V6～V8高變區DGGE圖譜

2.3 產甾體皂苷內生菌株的篩選

2.3.1 顏色反應篩選結果

根據Liebermann反應、Liebermann-Burchard反應、三氯乙酸反應以及氯仿-濃硫酸反應的需要，分別將上述制備的22株可純培內生細菌發酵液總皂苷提取物，配制成不同溶劑的樣品溶液。顏色反應結果表明：有3株細菌初步具有產甾體皂苷的特征，分別是磚紅色微桿菌Microbacteriumtestaceum(EBPDAK002)、墨西哥假黃單胞菌Pseudoxanthomonasmexicana(EBNDX002)、山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae(EBNDX003)，具體反應結果見表4。

表4 菌株發酵液提取物甾體皂苷顏色反應結果

2.3.2 TLC篩選結果

分別取上述3株內生細菌發酵液總皂苷提取物和襄麥冬總皂苷提取物的甲醇溶液，進行薄層層析分析。在展開劑的作用下，襄麥冬總皂苷最終跑出7個條帶(目前，已從襄麥冬中分離出14種甾體皂苷分子[3]，這表明本實驗中襄麥冬甾體皂苷的提取條件以及TLC展開條件均有待繼續優化)，菌株 EBPDAK002、EBNDX002、EBNDX003分別跑出3、2、6個條帶，TLC圖譜表明(見圖3)，3個樣品與襄麥冬總皂苷提取物均有相對應的條帶，對應的遷移率Rf值也大致相同(見表5)：與襄麥冬總皂苷提取物TLC條帶相比，EBPDAK002有4個條帶的遷移距離與其相近，EBNDX002、EBNDX003則各有1個條帶相近。以上結果進一步證明了3株內生細菌具有產甾體皂苷特征。

表5 內生細菌發酵液總皂苷提取物TLC結果

圖3 內生細菌發酵液總皂苷提取物TLC圖譜

2.3.3 HPLC篩選結果

以提取的襄麥冬塊根總甾體皂苷為陽性對照，對上述3株內生菌發酵液總皂苷提取物進行HPLC梯度檢測，結果進一步證明上述3種內生細菌具有自主代謝產生甾體皂苷的能力。由圖4A可知，墨西哥假黃單胞菌的發酵液總皂苷，其樣品過柱子以后，分別在3.15、15.98、54.85、57.64、75.19 min等時間點出現了與陽性對照對應的特征峰，表明該菌株能產生的甾體皂苷至少有5種與寄主植物的一樣。由圖4B可知，來自山羊葡萄球菌的樣品，在4.42、15.98、20.73、57.64、75.19 min時間點也出現了5個特征峰與陽性對照一致；圖4C則顯示了磚紅色微桿菌提取物樣品在三個時間點即15.98、57.64、75.19 min出現了三個與陽性對照對應的特征峰。有趣的是，2種內生菌株均在15.98、57.64、75.19 min時間點出現了特征峰，這表明在它們代謝產生的甾體皂苷中，至少有3種是相同的種類。

圖4 內生細菌發酵產物總皂苷提取物的HPLC色譜圖

3 討論與結論

利用傳統微生物純培方法，本研究從不同生育期襄麥冬塊根和須根中分離獲得15屬22種的內生細菌，其中芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬各有4種菌，假單胞菌屬有2種菌，其余的12個屬，包括沙門氏菌屬Salmonella、腸桿菌屬Enterobacter、假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas、摩根菌屬Morganella、農桿菌屬Agrobacterium、微桿菌屬Microbacterium、產卟啉桿菌屬Porphyrobacter、不動桿菌屬Acinetobacter、賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium、短小桿菌屬Curtobacterium，均只有1種菌。

通過16S rDNA-PCR-DGGE鑒定，本研究發現在襄麥冬的塊根始見期、迅速膨大期、成熟采收期，其內生細菌群落結構基本相同，菌株類群差異很小。通過序列比對，從分離序列中鑒定出15屬21種的細菌類群，其中芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄菌屬Staphylococcus各有3種細菌，沙雷氏菌屬Serratia、假黃單胞菌屬Pseudomonas各有2種，其余的11個屬，包括假單孢屬Pseudomonas、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養單胞菌屬Stenotrophomonas、產卟啉桿菌屬Porphyrobacter、短小桿菌屬Curtobacterium、腸桿菌屬Enterobacter、甲基桿菌屬Methylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、微桿菌屬Microbacterium、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter，均只有1種菌株。相比上述22株可純培內生細菌，DGGE又新鑒定出7個屬：沙雷氏菌屬Serratia、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養單胞菌屬Stenotrophomonas、甲基桿菌屬Methylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter。

本研究對可純培內生菌株的產皂苷能力進行了評估，初步鑒定墨西哥假黃單胞菌Pseudoxanthomonasmexicana、山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae、磚紅色微桿菌Microbacteriumtestaceum3株細菌具有明顯產甾體皂苷特征。根據HPLC檢測結果，這三株內生細菌均在15.98、57.64、75.19min時間點出現了特征峰，表明它們的發酵物中至少可能有3種皂苷是相同結構，這有待后續實驗進一步證明。目前，對甾體皂苷類化合物的檢測有兩種主要策略：一種是直接檢測，另一種是通過對裂解的皂苷元進行定性、定量分析來間接檢測。有學者采用HPLC法先后對穿山龍[18]、箭根薯[19]、劍麻[20]、百合珠芽[21]中的薯蕷皂苷元進行了測定。本實驗由于未獲得襄麥冬甾體皂苷標準品和分離的純品，暫用制備的襄麥冬塊根甾體皂苷(混合物)作為陽性對照，通過比對相同檢測條件下能否出現相同時間點特征峰的方式，初步鑒定了內生細菌的產苷特性，后續本實驗室將進一步對發酵產物皂苷提取物進行分離純化，采用質譜、核磁共振等手段進行更精確地表征。

根據16S rDNA V6～V8高變區DGGE分析結果，并結合可產甾體皂苷的可純培內生細菌的篩選結果，本實驗發現一個現象：在襄麥冬塊根迅速膨大期和成熟采收期，均能從其塊根中檢測到墨西哥假黃單胞菌P.mexicana的存在，而始見期塊根中卻未能檢測出。已經證實襄麥冬塊根的生物量以及甾體皂苷的含量是從始見期開始逐步升高，會在迅速膨大期和成熟期采收達到頂點[22,23]。這種現象是不是意味著，墨西哥假黃單胞菌在襄麥冬塊根甾體皂苷的累積中發揮著正相關的作用？這同樣有待后續實驗進一步證明。