松花粉對環磷酰胺致卵巢早衰大鼠的卵巢保護作用

何毓婕，曲 濤，王 桐，何志勇，王召君，秦 昉，曾茂茂，陳 潔*

1江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122；2煙臺新時代健康產業有限公司，煙臺 264000

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指卵巢功能衰竭所致的40歲之前閉經的現象，其特點是促性腺激素水平的升高和雌激素水平的降低[1]，卵巢早衰還可能導致不孕等臨床癥狀。POF的發生率約為1%～3%，且有逐漸升高和年輕化的趨勢[2]。多種因素可誘發POF，如環境因素、遺傳因素和疾病因素等[3]。因此，POF的預防和治療受到了全社會的廣泛關注。

目前，POF常用的治療方法是激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)，如使用天然雌激素雌二醇或孕激素黃體酮等[3]。在腫瘤患者中，促性腺激素釋放的激素類似物也被證明在預防化療引起的POF具有較好的效果[4]。然而，使用激素替代療法可能會帶來更高的罹患乳腺癌、中風和膽囊疾病風險[5,6]。眾所周知，中草藥特別是傳統的藥食兩用材料具有很高的安全性。有研究表明，中草藥治療比HRT治療在降低FSH水平方面具有更好的效果[7]。因此，開發基于藥食同源的更加安全有效的卵巢保護產品對于維護人民身體健康具有重要意義。

松花粉是馬尾松或油松等幾種同屬植物的雄性生殖細胞，含有蛋白質、氨基酸、酶、維生素、礦物質、核酸、黃酮、多糖、膽堿、植物甾醇等200多種營養和活性物質，被報道具有保護肝臟、增強免疫力和抗腫瘤作用[8]，以及減少炎癥反應和氧化應激的能力[9]。此外，松花粉也被證實具有保護前列腺的作用[10]，這表明其可能具有保護生殖系統的能力。松花粉中多糖的含量較高，且其結構與枸杞和當歸多糖相似，而枸杞多糖[11]和當歸多糖[12]被報道具有卵巢保護特性。松花粉中還含有大量柚皮素[13]，而柚皮素被認為具有雌激素樣作用，可以與雌激素受體結合以維持生理功能[14]。因此，松花粉具有卵巢保護的潛力，但目前松花粉的功能研究很少涉及到卵巢保護。

本文采用環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)誘導建立POF大鼠模型，灌胃高中低3種劑量的松花粉懸液，研究松花粉對卵巢形態、血清激素水平、炎癥因子濃度、卵巢抗氧化酶活性以及抗顆粒細胞凋亡的作用及可能機制，以期為基于卵巢保護的松花粉功能性產品的開發提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及環境

SD大鼠(雌性，10周齡，體重約250 g)，浙江維通利華實驗動物技術有限公司，許可證SCXK(浙)2019-0001，飼養于溫度20～26 ℃，濕度55%～70%，照度15～20lx的屏障設施內，每籠4只，照明時間為每天12 h，期間自由進食飲水。

1.2 藥品與試劑

破壁云南松花粉(新時代健康產業(集團)有限公司)；環磷酰胺一水合物(Cyclophosphamide monohydrate)(美國Sigma公司，批號為：WXBD0060V)；紅麗來結合雌激素片(新疆新姿源生物制藥有限責任公司，批號為：20200404)；大鼠雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、抗苗勒試管激素(anti-Muller tube hormone，AMH)、抑制素B(Inhibin B，INHB)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)Elisa試劑盒(武漢伊萊特生物科技股份有限公司，批號分別為：X2EMIUXXF8、ISDMZHEPUL、DPGZG43U1U、QVZHNJPL6W、J2W5 REJ4J2、XDUTTUKQH7、F5W496GZSQ、V8TD13EG W9)；總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活力、過氧化氫酶(catalase，CAT)活力測定試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、伊紅-蘇木素(hematoxylin and eosin，H&E)染色試劑盒，一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)(上海碧云天生物技術有限公司，貨號分別為：S0119、S0101S、S0056、S0051、P0010S、C0105M、C1088)；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體(英國Abcam公司，批號分別為：GR3275117-9、GR249198-97、GR3241586-15)；Cleaved Caspase-3抗體(美國CST公司，批號為：47)。

1.3 儀器與設備

SpectraMax190酶標儀(美國分子儀器公司)；GZP-150N光照培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)；3K15冷凍離心機(美國Sigma公司)；XB70雪花制冰機(美國Grant公司)；SB5200超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；IKA VORTEX 3旋渦混勻儀、C-MAG HS7磁力攪拌儀(德國IKA儀器有限公司)；Spectra MAX 190酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Leica ASP300S型全自動脫水機、Leica RM2255型半自動切片機、Leica TS5015型全自動染色機(德國徠卡儀器有限公司)；奧林巴斯BX51型光學顯微鏡(日本奧林巴斯光學儀器設備有限公司)；Trans-Blot Turbo半干轉印系統、164-5050基礎電源電泳儀、165-8003小型垂直電泳槽(美國伯樂公司)；iBright FL1500成像系統(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、造模及給藥

取雌性SD大鼠48只，體重250 ± 10 g，適應性喂養1周后，隨機分為6組，每組8只，分別為空白對照組、卵巢早衰模型組、陽性藥物對照組、松花粉高、中、低劑量組。空白對照組腹腔注射生理鹽水，其余組均腹腔注射環磷酰胺(第1天60 mg/kg，后14天10 mg/kg劑量)造模，造模期間每天刮取陰道分泌物制作陰道涂片觀察動情周期，動情周期紊亂或者延長則視為造模成功，造模成功的大鼠納入后續實驗。實驗組分別連續28天灌胃高(1.5 g/kg)、中(0.5 g/kg)、低(0.1 g/kg)不同劑量的破壁松花粉，陽性對照組灌胃結合雌激素溶液(0.075 g/kg)，空白對照組及模型組灌胃生理鹽水。每周記錄大鼠體重變化，末次給藥后大鼠禁食12 h，異氟烷吸入麻醉后腹主動脈取血，于4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，取上層血清用于激素和炎癥因子的測定。取出卵巢組織，剔除脂肪后稱重，計算卵巢指數。稱重后的卵巢一部分用4%多聚甲醛固定用以后續的病理切片，另一部分采用液氮速凍后置于-80 ℃備用，用于抗氧化和抗凋亡指標的測定。本實驗方案經江南大學實驗動物中心倫理委員會批準實施，審批號為JN.No20201030S1201203[272]，所有動物實驗操作符合江南大學動物管理與使用委員會的規定(SYXK2012-0002)。

1.4.2 卵巢指數計算

卵巢指數的計算公式如下：

卵巢指數(g/100 g)=

單個卵巢重量(g)/大鼠體重(g)×100

(1)

1.4.3 卵巢組織病理學觀察

4%多聚甲醛固定的卵巢使用梯度酒精脫水，石蠟包埋，連續切片，蘇木精伊紅染色后，于光學顯微鏡下觀察卵巢組織的形態學變化，觀察內容包括卵巢的始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡及黃體數的變化及卵巢皮質、髓質、卵母細胞、顆粒細胞和細胞間質等病理改變。

1.4.4 血清中激素和炎癥因子水平的測定

采用酶聯免疫吸附分析(Elisa)試劑盒測定血清中的E2、P、LH、FSH、AMH、INHB、TNF-α和IL-4等激素和炎癥因子水平，所有實驗操作均按照試劑說明書進行。

1.4.5 顆粒細胞凋亡水平的檢測

采用原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)試劑盒測定卵泡周圍顆粒細胞的凋亡水平，具體步驟嚴格按照說明書進行。操作完成后于熒光顯微鏡下拍攝清晰照片，隨機選取5個最高視野用于凋亡細胞計數和凋亡指數計算。

凋亡指數計算公式如下：

凋亡指數=凋亡細胞/細胞總數×100%

(2)

1.4.6 卵巢組織中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT的測定

采用商業化試劑盒測定卵巢組織中SOD、GSH-Px、CAT的活力和T-AOC水平，所有實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.4.7 卵巢組織凋亡因子的表達

采用蛋白質印跡(Western blot)法測定卵巢組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved Caspase-3四種凋亡因子的表達。將冷凍的卵巢在冰上剪切，然后在RIPA裂解緩沖液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)中勻漿，靜置30 min。裂解液以14 000 r/min離心10 min，用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液的蛋白濃度。在上清液中加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液，沸水煮10 min，將煮沸的樣品進行電泳分析。使用半干轉印系統將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉2 h。封閉后PVDF膜用TBST洗滌3次，加入不同的一抗(見表2)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，加入二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔)室溫孵育1 h。用TBST洗滌3次后，將ECL化學顯色液均勻滴在PVDF薄膜上，用化學發光成像系統檢測發光強度并用ImageJ進行灰度值分析，以β-actin為內參計算四種凋亡蛋白的表達水平。

1.4.8 數據處理

數據用平均值±標準偏差表示，所有處理重復3～6次，采用Excel 2016進行數據分析并作圖。采用Statistix 9(Tallahassee，FL，USA)進行數據統計和顯著性分析，P<0.05為具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 松花粉對卵巢早衰大鼠卵巢指數的影響

如圖1所示，空白對照組的卵巢指數最高，模型組的卵巢指數最低，約為空白組的52%。松花粉高劑量組、中劑量組、低劑量組的卵巢指數呈梯度下降趨勢，且高劑量組的卵巢指數與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)，低劑量組的卵巢指數與模型對照組無顯著性差異(P>0.05)。結果表明，松花粉有增加卵巢指數的作用。

圖1 松花粉對大鼠卵巢指數的影響

2.2 松花粉對大鼠卵巢組織病理形態的影響

卵巢病理切片如圖2所示。空白對照組的卵巢內可見大量各級卵泡及黃體，未見閉鎖卵泡(見圖2A)。模型組的卵泡數量明顯減少，幾乎不見正常發育卵泡，且該組的閉鎖卵泡數量最多(見圖2B)。陽性對照組各級卵泡數與空白對照組相近，無閉鎖卵泡(見圖2C)。高劑量松花粉組可見大量成熟卵泡，未見閉鎖卵泡(見圖2D)。中劑量組可見各級卵泡和閉鎖卵泡(見圖2E)。與中劑量組相比，低劑量組有少量正常發育的卵泡和更多閉鎖卵泡(見圖2F)。此外，低劑量組和模型組的卵巢間質有一定程度的纖維化。上述結果表明，松花粉可以增加各級卵泡的數量，減少閉鎖卵泡的數量。

圖2 各組大鼠的卵巢組織病理形態(100×)

2.3 松花粉對大鼠血清激素的影響

各組大鼠血清中E2、P、LH、FSH、AMH和INHB的水平如圖3所示。模型組E2水平與空白組相比降低了17.7 pg/mL，而P、LH和FSH水平分別增加了5.26 ng/mL、21.67 mIU/mL和275.03 ng/mL(P<0.05)。灌胃陽性藥物后，激素水平與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)。灌胃高、中、低劑量松花粉后，高劑量組6項激素水平與空白對照組均無顯著差異(P>0.05)或顯著(P<0.05)優于空白組，中劑量組的各項激素水平與模型組相比均有顯著(P<0.05)改善，低劑量組與模型組相比，FSH和INHB水平顯著(P<0.05)降低了184.27 ng/mL和643.08 pg/mL，AMH顯著提高了1.06 ng/mL(P<0.05)，但E2、P和LH的水平與模型組無顯著差異(P>0.05)。結果表明，高、中劑量松花粉可以有效調節性激素與促性腺激素水平并提升卵巢的儲備功能。

圖3 松花粉對大鼠血清E2、P、LH、FSH、AMH和INHB水平的影響

2.4 松花粉對大鼠卵巢細胞凋亡情況的影響

DAPI是一種熒光染料，可以與DNA強力結合，細胞被染色后在熒光顯微鏡下觀察有藍色熒光，可以表征細胞總數。TUNEL法采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶將熒光素標記到凋亡細胞中斷裂的染色體DNA產生的大量粘性3′-OH末端，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞有綠色熒光。如圖4中所示，DAPI和TUNEL分別表示細胞總數和凋亡細胞結果，Merge為合并結果，計數后可用于計算顆粒細胞凋亡指數(見表1)。

圖4 松花粉對大鼠卵泡顆粒細胞凋亡水平影響

如圖4和表1所示，空白對照組中綠色熒光標記的凋亡顆粒細胞很少，對應的凋亡指數約為2.81%。陽性對照組與空白對照組無明顯差異(P>0.05)。模型組閉鎖卵泡周圍可見大量凋亡細胞，凋亡指數最高，約為27.58%。高劑量組顆粒細胞凋亡指數與空白組無顯著差異(P>0.05)且顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)。因此，可以推斷松花粉具有抗顆粒細胞凋亡作用。

表1 顆粒細胞凋亡指數

圖5為采用Western blot檢測四種凋亡蛋白在卵巢中表達的結果，其中柱狀圖為四種蛋白條帶以β-actin為內參的灰度值結果。模型組與空白組相比，卵巢Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表達顯著增加，Bcl-2的表達顯著降低(P<0.05)。經松花粉灌胃后，Bcl-2和Bax的比例較模型組顯著提高且具有量效關系，Caspase-3和Cleaved Caspase-3均有顯著下降，高劑量組17 kDa的Cleaved Caspase-3下降最為顯著(P<0.05)。結果表明，松花粉可以調控凋亡蛋白的表達且具有一定的量效關系。

圖5 松花粉對大鼠卵巢凋亡因子表達的影響

2.5 松花粉對大鼠卵巢抗氧化能力的影響

圖6展示了不同劑量松花粉對大鼠卵巢抗氧化能力的影響。模型組的總抗氧化能力(T-AOC)較空白組顯著(P<0.05)降低，高劑量組T-AOC較模型組提高了70.30%。卵巢中的其他三種抗氧化酶活力也顯示出類似的趨勢。模型組的GSH-Px、SOD和CAT的活力較空白組分別下降了46.61%、40.83%和39.70%，灌胃不同劑量的松花粉后，大鼠卵巢抗氧化酶活力均有一定程度的提升，但僅有高劑量組對三種酶活的提升有顯著性(P<0.05)。結果表明，松花粉能夠提升POF大鼠卵巢的抗氧化能力，且部分具有一定的量效關系。

圖6 松花粉對大鼠卵巢T-AOC、GSH-Px、SOD和CAT的影響

2.6 松花粉對大鼠抗炎能力的影響

大鼠血清炎癥因子水平如圖7所示。模型組的兩種炎癥因子均呈現較高濃度，比空白對照組顯著(P<0.05)提高近3倍。灌胃松花粉后，TNF-α和IL-4均顯著下降，且高、中劑量組與空白組無顯著差異(P>0.05)。

圖7 松花粉對大鼠血清TNF-α和IL-4的影響

3 討論與結論

松花粉為藥食同源原料，其營養成分和功能性質均被廣泛研究。有研究表明其具有前列腺保護的功能[10]，且同時具備抗氧化和抗炎的功效[9]，本文通過環磷酰胺誘導大鼠POF模型探討松花粉對卵巢的保護功能。

患有POF的大鼠多出現與生殖系統相關的血清激素水平的變化，如E2和P水平的明顯降低[15]。然而，本文的結果顯示模型鼠中P的濃度相對空白組有明顯的升高。在POF大鼠中，卵巢囊腫和內分泌失調均可能導致P水平的增加[16]。LH和FSH均由垂體分泌，可調節性激素的合成，促進卵泡成熟和黃體生成[17]。CTX可擾亂與卵巢相關的激素分泌，本研究結果與其他研究一致[18]。卵巢儲備是指卵巢皮質中所含原始卵泡的儲備，AMH和INHB為主要的判斷指標。卵巢組織病理學結果顯示模型組卵泡數明顯下降，與AMH降低的結果一致。INHB是生殖細胞分泌的一種激素，與生殖能力密切相關，其主要功能是調節FSH的產生[19]。有研究表明，FSH和INHB之間存在負反饋調節[19]，而本文的結果與之相反，原因可能如Carballo等[20]所述，INHB的高水平分泌表明顆粒細胞中存在腫瘤。本文的結果表明，經松花粉灌胃后，大鼠血清激素分泌趨向正常水平，松花粉有調節激素的功能且有量效關系。

CTX誘導POF的主要機制是誘導顆粒細胞凋亡[21]，顆粒細胞的大量凋亡可直接影響卵泡的生長，最終發展為閉鎖卵泡[22]，進而導致卵巢內的卵泡數量明顯減少甚至耗盡，卵巢儲備能力下降。Caspase-3僅出現在閉鎖卵泡的顆粒細胞中，而不出現在健康卵泡的顆粒細胞中[23]。Bcl-2相關的促凋亡和抗凋亡蛋白在Caspase蛋白酶上游的細胞內死亡程序的決策步驟中具有重要作用[24]。本研究中松花粉可以調節凋亡蛋白表達，提高Bcl-2和Bax的比例，降低Cleaved Caspase-3的表達，從而抑制顆粒細胞凋亡，促進卵泡的正常發育。

卵巢損傷可由自由基誘導的氧化應激引起，例如活性氧和過氧化氫，氧化應激水平增加最終可以導致DNA損傷和顆粒細胞的凋亡[25]。對于女性生殖系統，抗氧化劑被認為是卵巢生理代謝的關鍵因素，可以有效降低這些自由基的水平，維護卵巢的健康[26]。然而，它們的確切分子機制和作用尚未完全闡明。CAT、SOD和GSH-Px均在性激素調節中發揮關鍵作用[27]。本文的結果也表明，高劑量松花粉可以顯著提高卵巢的抗氧化酶活性，對卵巢功能具有重要意義。

炎癥也是卵巢衰老的可能途徑之一，長期的炎癥可導致卵巢發生病理變化。腫瘤壞死因子和白細胞介素均是主要的炎癥因子，且在卵巢功能減退的大鼠中有較高的表達[28]。有研究認為，卵巢的炎性衰老本質上與氧化應激水平有關，氧化應激與炎癥反應互為因果[29]。本研究結果也表明POF大鼠血清的TNF-α和IL-4的濃度升高，有較強的炎癥反應，而松花粉可以降低炎癥反應的程度。

本文證實了松花粉對CTX誘導的POF大鼠的卵巢具有保護作用，如調節雌激素E2、P和促性腺激素FSH、LH水平、抗顆粒細胞凋亡并調節凋亡因子Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3，提高抗氧化能力并提高抗氧化酶GSH-Px、SOD、CAT活力和降低炎癥因子TNF-α和IL-4水平的作用，且松花粉的功能與劑量有一定的相關性。松花粉中含有大量的多糖以及黃酮類化合物，可能與松花粉保護卵巢的功能有關，尚待進一步研究。本研究為以松花粉為原料開發具有卵巢保護功能的健康產品具有一定的理論和實際應用價值。