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不同干燥方法對(duì)栽培川貝母外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量的影響

2022-07-07 09:25:52種葉敏陳穎馨蔡曉洋
關(guān)鍵詞:方法

李 巧,種葉敏,陳穎馨,蔡曉洋,李 敏*,黃 勇

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 省部共建西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137;2四川綠林川貝母種植有限公司,涼山彝族自治州 615000

川貝母FritillariacirrhosaD.Don,又稱卷葉貝母,為川貝母藥材的來(lái)源之一,具有清熱潤(rùn)肺,化痰止咳,散結(jié)消癰的功效[1],主要含有生物堿類、核苷類成分[2],同時(shí)淀粉占整個(gè)貝母總生物量70%~80%[3]。喜生長(zhǎng)于海拔3 200~4 600 m的高山灌叢草甸地帶,土壤比較濕潤(rùn)的向陽(yáng)草坡,主要分布于四川、西藏、云南等地[4,5],商品藥材主要以野生資源為主。但由于川貝母對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻、生物學(xué)產(chǎn)量低,加之過(guò)度采挖,川貝母基原植物的野生資源量急劇下降,國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(2021年公布)已將其納入二級(jí)保護(hù)野生植物。目前川貝母產(chǎn)業(yè)化栽培快速發(fā)展,其相關(guān)栽培技術(shù)已有較多研究且日益成熟[6,7],將逐步實(shí)現(xiàn)川貝母藥材生產(chǎn)以及藥用,減緩野生資源減少帶來(lái)藥材供不應(yīng)求的市場(chǎng)壓力。產(chǎn)地加工是川貝母藥材生產(chǎn)及質(zhì)量形成的源頭,是川貝母藥材生產(chǎn)與品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)。目前川貝母的產(chǎn)地初加工方法普遍采用曬干和烘干等傳統(tǒng)方法[8-10],具有規(guī)模小散、技術(shù)裝備落后、干燥周期長(zhǎng)、干燥過(guò)程難控等問(wèn)題。隨著川貝母栽培規(guī)模的擴(kuò)大,栽培品將逐漸走向市場(chǎng),傳統(tǒng)加工方法已無(wú)法滿足栽培品的生產(chǎn),因此研究栽培川貝母新的加工工藝成為行業(yè)迫切需要解決的問(wèn)題。

近年來(lái),中藥生產(chǎn)過(guò)程工業(yè)化程度不斷提升,現(xiàn)代干燥技術(shù)逐漸被引入中藥產(chǎn)地加工并進(jìn)行推廣,如三七[11]、人參[12]、當(dāng)歸[13]等,使其產(chǎn)地加工干燥速率提升的同時(shí),品質(zhì)也得到保障[14]。而貝母類藥材中,僅浙貝母有相關(guān)的研究報(bào)道[15,16],在川貝母中尚無(wú)研究及應(yīng)用。因此,基于上述問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較傳統(tǒng)曬干、熱風(fēng)干燥、真空干燥、真空冷凍干燥對(duì)川貝母藥材的外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量的綜合影響,通過(guò)多指標(biāo)對(duì)不同干燥方法川貝母的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),同時(shí)以聚類分析、主成分分析等方法進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià),以期為栽培川貝母產(chǎn)地干燥加工新技術(shù)的引進(jìn)與推廣提供理論參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DHG-9070B電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DAF-6050真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);FDU-2110真空冷凍干燥器(東京理化器械株式會(huì)社);Nikon SMZ745體視顯微鏡(日本尼康公司);CR-400色彩色差計(jì)(日本美能達(dá)公司);A580紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(上海翱藝儀器有限公司);Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司);DFD-700電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

對(duì)照品:西貝母堿(批號(hào):wkq19051302,四川省維克奇生物科技有限公司,純度≥98%);BC0705淀粉含量檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20220107,北京索萊寶科技有限公司)。

乙醇、三氯甲烷、溴甲酚綠、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉為分析純;乙腈、甲醇、冰醋酸為色譜純;水為超純水。

供試栽培川貝母為4~5年生植株,采挖自四川綠林川貝母種植有限公司生產(chǎn)基地,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為百合科川貝母FritillariacirrhosaD.Don的鱗莖。挑選無(wú)腐爛、無(wú)損傷、直徑1.0~1.5 cm的鮮鱗莖作為試驗(yàn)樣品。

2 方法

2.1 處理方法

試驗(yàn)設(shè)置4種干燥方法,即自然曬干、熱風(fēng)干燥、真空干燥、冷凍干燥,重復(fù)3次。除T3處理不清洗外,其余干燥前處理需去掉泥土及須根,清水洗凈后,瀝干水分。不同干燥處理的流程與參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 干燥處理方法及參數(shù)

2.2 評(píng)價(jià)方法

2.2.1 外觀形態(tài)觀測(cè)

按照生藥學(xué)常規(guī)性狀鑒定方法,觀察干燥后藥材的形狀、顏色、質(zhì)地、氣味等性狀。然后通過(guò)體視顯微鏡進(jìn)行藥材表皮及斷面觀察并局部放大拍照。同時(shí)參照2020年版《中國(guó)藥典》川貝母項(xiàng)下對(duì)表面及斷面特征進(jìn)行客觀量化評(píng)分,表面“類白色”得9~10分,“類白色或淺黃色”得6~8分,“淺黃色或黃色”得3~5分,“黃色或棕黃色”得0~2分;斷面“白色,富粉性”得9~10分,“白色,具粉性”得6~8分,“淺黃色,粉性差”得3~5分,“淺黃色,呈角質(zhì)”得0~2分。

2.2.2 色度測(cè)量方法

參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行測(cè)定[17],采用色度計(jì)對(duì)樣品粉末進(jìn)行客觀、量化分析,為不同干燥方法川貝母藥材的色差提供客觀數(shù)據(jù),每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。

2.2.3 水分和浸出物測(cè)定

水分參照2020年版《中國(guó)藥典》第一部川貝母項(xiàng)下方法測(cè)定;浸出物參照2020年版《中國(guó)藥典》第一部川貝母項(xiàng)下方法測(cè)定,用稀乙醇做溶劑。

2.2.4 總生物堿含量測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典》第一部川貝母項(xiàng)下紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定。

2.2.4.1 供試品制備

精密稱取樣品粉末(過(guò)3號(hào)篩)2 g,置具塞錐形瓶中,加濃氨試液3 mL,浸潤(rùn)1 h,加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL,置80 ℃水浴加熱回流2 h,放冷,濾過(guò),濾液置50 mL量瓶中,用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2~3次,洗液并入同一量瓶中,加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液至刻度,搖勻,即得供試品溶液。

2.2.4.2 線性關(guān)系考察

精密稱取西貝母堿對(duì)照品2.0 mg,加三氯甲烷溶解并定容至10 mL,配制成0.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。再分別精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL,置25 mL具塞試管中,分別補(bǔ)加三氯甲烷至10.0 mL,精密加水5 mL、再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL,密塞,劇烈振搖1 min,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,放置30 min。取三氯甲烷液,用干燥濾紙濾過(guò),取續(xù)濾液,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可見(jiàn)分光光度法(通則0401),在415 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y= 2.774X-0.024 1,r2= 0.999 5,線性范圍為0.022~0.221 mg/mL。

吸取供試品溶液2~5 mL,按相同方法進(jìn)行顯色,并測(cè)定吸光值,將樣品吸光值代入回歸方程計(jì)算,即得樣品中總生物堿含量。

2.2.5 淀粉含量測(cè)定(微量法)

2.2.5.1 測(cè)定原理

利用80%乙醇將川貝母中可溶性糖與淀粉分開(kāi),采用酸水分解法分解淀粉為葡萄糖,采用蒽酮比色法測(cè)定葡萄糖含量,計(jì)算淀粉含量。

2.2.5.2 供試品制備

精密稱定川貝母藥材粉末5 mg,加入1 mL淀粉含量檢測(cè)試劑盒(BC0705)中的試劑一,80 ℃水浴提取30 min,常溫離心5 min(3 000 g),棄上清液,留沉淀,再加入0.5 mL雙蒸水,沸水浴糊化15 min,取出冷卻,加入上述試劑盒中的試劑二1 mL,沸水浴提取15 min,振蕩3~5次,冷卻后,常溫離心15 min(8 000 g),取上清液,稀釋50倍,待測(cè)。

2.2.5.3 線性關(guān)系考察

稀釋葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液得到0.4、0.2、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液,各吸取50 μL,以蒸餾水做空白,加入250 μL試劑盒中的工作液至EP管,95 ℃水浴10 min。自然冷卻至室溫,在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,計(jì)算ΔA=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。以濃度(X)為橫坐標(biāo),ΔA為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程Y= 3.094 4X-0.010 6,r2= 0.999 1,線性范圍為0.008~0.7 mg/mL。

吸取供試品50 μL,按相同方法進(jìn)行顯色,并測(cè)定吸光值,將樣品吸光值代入回歸方程計(jì)算,即得樣品中總淀粉含量。

2.2.5.4 淀粉含量的計(jì)算

淀粉含量計(jì)算公式為:淀粉含量=X×V÷W÷1.11×F÷1 000×100%。

其中X為線性回歸方程計(jì)算所得濃度;V為提取后體積,1.5 mL;W為稱樣量(g);F為稀釋倍數(shù);1.11是此法測(cè)得葡萄糖含量換算為淀粉含量的常數(shù),即111 μg葡萄糖用蒽酮試劑顯色相當(dāng)于100 μg淀粉用蒽酮試劑顯色的顏色。

2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2019進(jìn)行整理計(jì)算,采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析(SNK),采用Origin 2022軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類及相關(guān)性分析并作圖,采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)主成分分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同干燥方法對(duì)栽培川貝母藥材外觀性狀的影響

不同干燥方法對(duì)栽培川貝母藥材的外觀性狀的影響,見(jiàn)表2及圖1。真空冷凍干燥藥材保持了川貝母鮮鱗莖的原有色澤性狀,表面顏色類白色,表皮易脫落,斷面質(zhì)地松泡多孔,富粉性,氣微,苦味明顯。熱風(fēng)干燥、真空干燥2種處理下的藥材外觀性狀差異較小,其表面呈淺黃色或棕黃色,且隨著溫度的增加其顏色加深,同時(shí)斷面特征明顯可見(jiàn)部分淀粉已變性,轉(zhuǎn)化為角質(zhì)團(tuán)塊;相同溫度下,經(jīng)105 ℃殺青處理后,其表面顏色為棕黃色,斷面呈角質(zhì)狀,改變了粉性的特征,與傳統(tǒng)記載川貝母藥材差異明顯,同時(shí)未水洗處理相較于水洗后干燥組,表面呈泥土色,體視顯微鏡下表皮可見(jiàn)明顯的泥土。曬干為傳統(tǒng)的干燥方法,加工后性狀藥材表面顏色為類白色,斷面粉性足,但由于栽培品含水量相較于野生品高,其干燥耗時(shí)長(zhǎng),部分表面氧化呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)。

表2 不同干燥方法處理后川貝母藥材的性狀特征

圖1 不同干燥方法栽培川貝母藥材外觀性狀

同時(shí),色差儀測(cè)定粉末色差值結(jié)果見(jiàn)表3,測(cè)定結(jié)果中明亮度(L)值越大,顏色越白[18]。與肉眼觀察結(jié)果基本一致,除冷凍干燥外,其余組粉末顏色的L值普遍低于傳統(tǒng)曬干組,但以T4處理與傳統(tǒng)曬干ΔE最小,粉末顏色值與傳統(tǒng)曬干組最接近。

表3 不同干燥方法川貝母藥材粉末顏色測(cè)定值

3.2 不同干燥方法對(duì)栽培川貝母折干率及各成分的影響

由結(jié)果可見(jiàn),不同干燥方法處理后川貝母藥材折干率及各成分含量具有一定差異(見(jiàn)表4)。曬干處理耗時(shí)長(zhǎng)、干燥速率慢,藥材折干率顯著提高(P< 0.05);熱風(fēng)干燥、真空干燥、冷凍干燥可不同程度減少干燥耗時(shí),提高干燥速率,但折干率稍有下降。不同處理組浸出物在22.18%~24.67%之間,符合《中國(guó)藥典》2020年版川貝母項(xiàng)下規(guī)定最低限量(9.0%),其中T2浸出物顯著增加(P< 0.05),因殺青時(shí)高溫促使藥材中淀粉溶脹、分裂,經(jīng)糊化后其淀粉分子間氫鍵斷裂,更易溶解于水中,同理其淀粉含量最低。與其他處理相比,冷凍干燥總生物堿、總淀粉含量均有不同程度的提高,其中相較于傳統(tǒng)曬干T1分別提高了38.40%、12.38%(P< 0.05)。不同溫度處理下,各成分含量呈現(xiàn)出隨著溫度的升高而逐漸降低的趨勢(shì),以T4處理下最高(P< 0.05),說(shuō)明高溫下其總生物堿會(huì)進(jìn)行分解,同時(shí)加劇了鮮藥材干燥過(guò)程中的呼吸作用,加劇了內(nèi)部淀粉與糖分的分解,使得總淀粉含量降低。此外,比較T3、T4可知,栽培川貝母經(jīng)水洗后,其浸出物、總生物堿顯著增加(P< 0.05),總淀粉含量無(wú)顯著性變化(P> 0.05)。

表4 栽培川貝母折干率、水分、浸出物、總生物堿、總淀粉的含量

3.3 聚類分析(HCA)

聚類分析(HCA)使用Origin 2022軟件,以上述各指標(biāo)為變量,采用組間聯(lián)接法,以歐氏距離平方(SED)為測(cè)度,采用系統(tǒng)聚類分析法對(duì)8批栽培川貝母藥材進(jìn)行模式識(shí)別分析,結(jié)果見(jiàn)圖2所示。8批不同干燥方法川貝母被分為4類,T1、T3、T4、T5為一類、T2、T6為一類,T7、T8分別單獨(dú)為一類。因此可知,采用聚類分析可將凍干處理組、真空干燥組與傳統(tǒng)曬干很明顯區(qū)分,而熱風(fēng)干燥組中50~55 ℃與傳統(tǒng)干燥外觀性狀與內(nèi)在質(zhì)量相似,被聚為一類,但是熱風(fēng)干燥組中T2、T6由于均經(jīng)高溫處理,其淀粉易糊化,導(dǎo)致質(zhì)地偏角質(zhì)化,與傳統(tǒng)質(zhì)地粉性不符,因此被單獨(dú)歸為一類。可見(jiàn),聚類分析法既能反應(yīng)8種干燥方法的相似性,又能反映差異。

圖2 系統(tǒng)聚類熱圖

3.4 主成分分析(PCA)

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同干燥方法對(duì)川貝母質(zhì)量的影響,對(duì)已測(cè)定的浸出物、總生物堿含量、總淀粉含量、顏色值L*、a*、b*以及表面、斷面得分為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件,采用無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別法PCA進(jìn)行分析,前3個(gè)主成分的特征值均>1,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)90.5%(見(jiàn)表5)。因此提取前3個(gè)主成分分析較為合適。因子載荷矩陣結(jié)果見(jiàn)表6,主成分1主要反映淀粉、L*、b*、表面得分、斷面得分的信息(載荷因子絕對(duì)值>0.5),同理,主成分2主要反映a*、b*、斷面得分的信息,主成分3主要反映浸出物、總生物堿的信息。同時(shí)生成8批栽培川貝母的PCA得分圖(見(jiàn)圖3)。結(jié)果顯示,8批藥材基本可分為4組,冷凍干燥(T8)聚為一組,而熱風(fēng)干燥中殺青處理組(T2)與60 ℃干燥組(T6)聚為一組,真空干燥(T7)聚為一組,曬干、與剩余熱風(fēng)干燥處理組聚為一組,與聚類分析結(jié)果趨勢(shì)基本一致。

圖3 不同干燥方法川貝母PCA得分圖

表5 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表6 主成分因子載荷矩陣

3.5 藥材粉末顏色與有效成分含量之間相關(guān)性分析

將測(cè)定浸出物、總生物堿、總淀粉含量與顏色指標(biāo)值L*、a*、b*相關(guān)聯(lián),用Origin 2022軟件作相關(guān)性分析,結(jié)果顯示浸出物與顏色值L*、a*、b*無(wú)顯著性相關(guān),總生物堿與顏色值b*、表面得分的相關(guān)系數(shù)分別為-0.50、0.43,雙尾檢驗(yàn)的概率為P<0.05,說(shuō)明總生物堿與顏色值指標(biāo)b*有顯著性負(fù)相關(guān),與表面得分呈顯著性正相關(guān),說(shuō)明b*越大,總生物堿含量越低,表面得分越高,總生物堿含量越高。同理,淀粉含量與顏色值L*、b*、表面及斷面得分的相關(guān)系數(shù)為0.79、-0.42、0.97、0.92,雙尾檢驗(yàn)的概率分別為P< 0.001、P< 0.05、P<0.001、P<0.001,說(shuō)明總淀粉含量與顏色值L*、表面斷面得分成極顯著的正相關(guān),與顏色值b*呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明L*、表面得分、斷面得分越大,總淀粉含量越高;b*越大,總淀粉含量越低(見(jiàn)圖4)。

圖4 相關(guān)性分析圖

4 討論和結(jié)論

產(chǎn)地初加工是影響川貝母藥材生產(chǎn)及品質(zhì)的重要過(guò)程,川貝母本身性質(zhì)特殊,干燥難度大,難控制,在干燥過(guò)程中易產(chǎn)生油子、黃子等[19],加之栽培品鱗莖個(gè)頭較大且外觀形狀、質(zhì)地有一定的變化,藥材性狀更難掌控,容易出現(xiàn)表面顏色偏黃、粗糙,粉性不足等問(wèn)題。而目前川貝母藥材干燥方法仍主要是比較傳統(tǒng)的曬干法,對(duì)于栽培川貝母產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展具有一定局限性,如何在盡可能保持藥材性狀佳、成分含量高的同時(shí),簡(jiǎn)便高效地進(jìn)行干燥是亟待解決的問(wèn)題。本次試驗(yàn)比較了川貝母產(chǎn)區(qū)較為普遍的傳統(tǒng)曬干方法和現(xiàn)代新引進(jìn)的熱風(fēng)干燥技術(shù)、真空干燥技術(shù)、真空冷凍干燥技術(shù)對(duì)其外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量的影響,結(jié)果顯示傳統(tǒng)干燥方法雖在性狀上具有一定優(yōu)勢(shì),但其易受環(huán)境影響同時(shí)耗時(shí)長(zhǎng),生物堿類成分易損失,而冷凍干燥法能較好地保持藥材的外觀性狀,淀粉含量、總生物堿含量均最高,原因可能是由于冷凍干燥避免了高溫常壓蒸發(fā)對(duì)干燥物質(zhì)產(chǎn)生的氧化、分解現(xiàn)象,能較大程度地保持藥材原有的營(yíng)養(yǎng)成分和較高的有效成分[20,21];熱風(fēng)干燥(50~55 ℃)在提高干燥速率、縮短干燥時(shí)間,同時(shí)可較好地保持外觀性狀以及減少有效成分損失,但高溫105 ℃殺青或60 ℃較高溫度干燥的藥材,其淀粉顆粒發(fā)生糊化,質(zhì)地易由粉性變化為角質(zhì),同時(shí)使生物堿類物質(zhì)損失加快,淀粉加速分解為糖類物質(zhì),此種干燥方法雖快,但對(duì)其外觀形狀及有效成分影響顯著,故不適合栽培川貝母的干燥,可見(jiàn)溫度是引起藥材理化性質(zhì)和生物活性改變的關(guān)鍵[22]。

中藥材經(jīng)驗(yàn)鑒別為“辨狀論質(zhì)”,現(xiàn)代研究均表明中藥材性狀是判斷其品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[23],如安息香表面黃白色至黃棕色、斷面象牙白時(shí)其有效成分苯甲酸等含有量較高[24]。而傳統(tǒng)認(rèn)知,貝母“以鱗莖完整、均勻、色白,有粉性者為佳”[25],但缺乏定量檢測(cè)的方法,故本研究引入色度分析原理以及淀粉含量對(duì)川貝母藥材的顏色、粉性進(jìn)行了客觀量化,結(jié)果表明川貝母藥材偏白,其總生堿含量及淀粉含量相對(duì)較高。但由于本次實(shí)驗(yàn)干燥樣品數(shù)量有限以及分析化學(xué)成分種類不夠全面,因此在預(yù)測(cè)色差值與有效成分相關(guān)性仍需建立更全面的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)方法以及收集大量樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述,干燥方法是影響藥材外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量的重要因素。傳統(tǒng)曬干在栽培川貝母的產(chǎn)地加工中具有一定局限性,僅適用于較小的鱗莖且保證陽(yáng)光充足的情況。熱風(fēng)干燥方法所得藥材在外觀或質(zhì)量上與傳統(tǒng)曬干最為類似,在一定程度上保證藥材外觀性狀的基礎(chǔ)上,不僅能減少有效成分分的損失,并且能提高干燥效率,減少干燥時(shí)間,為規(guī)模化生產(chǎn)節(jié)約時(shí)間成本,建議在生產(chǎn)上采用50~55 ℃熱風(fēng)干燥作為產(chǎn)地干燥方法。同時(shí)冷凍干燥因能較大程度地保留有效成分,因此以提取貝母有效成分為目的時(shí),可采用此方法進(jìn)行干燥,但冷凍干燥藥材質(zhì)地松泡,斷面空隙大且多,在后期包裝與貯藏中應(yīng)該注意特殊管理,避免受潮。

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