高速逆流色譜分離制備青桑葚中原花青素及其抗氧化活性研究

汪玉玲，蔡為榮，卓允允，王晴晴

安徽工程大學生物與食品工程學院，蕪湖 241000

桑葚(mulberry)，作為桑科植物桑樹的果實[1]，營養成分豐富，具有抗癌、抗氧化、鎮痛消炎、烏發美容等多種功效[2]。青桑葚，又被稱為黃桑葚，是指未成熟的桑葚，作為一種中藥材，相對于成熟桑葚青桑葚更易于采摘、運輸和貯存，且其成分中原花青素、兒茶素、表兒茶素類物質含量遠高于成熟桑葚[3]。國內外已有從葡萄籽、玫瑰花、玉米須、蔓越莓、可可豆等各種植物中提取分離原花青素的研究[4-8]，Liu等[9]使用LSA-10樹脂對山楂中的原花青素進行富集純化；Chen等[10]采用膜分離過濾法從葡萄籽中分離低聚原花青素，使低聚原花青素含量達65%，但未得到單體分離組分；Glavnik等[11]使用高效薄層色譜法分析了日本虎杖中的原花青素，從其粗提取物中鑒定出了原花青素的單體到十聚體以及B型原花青素，但該方法很難用于制備；Sun等[12]采用半制備高效液相色譜法從葡萄籽中分離原花青素，但預處理復雜，且分離量低；本文選擇高速逆流色譜法(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)，其分離量大，可進行批量制備分離，操作簡便，分離效率高。

原花青素(procyanidins，PC)，作為一種多酚類化合物廣泛存在于植物體中，它主要由兒茶素、表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)以及表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)等聚合而成，有較強的抗氧化活性[13,14]。本工作擬利用高速逆流色譜法從青桑葚中分離純化原花青素類物質，應用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)鑒定各組分化學成分和分析其純度；通過考察各組分的DPPH自由基、ABTS+自由基以及羥自由基的清除能力，反映其抗氧化能力強弱。這一工作拓展了桑葚深加工利用的范圍，為青桑葚原花青素工業化生產提供方向，對桑葚作為藥用資源的開發利用具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

青桑葚購自陜西天璽尚品商貿有限公司，40 ℃烘干1 h，至青桑葚含水量低于10%后粉碎，粉碎后過60目篩，低溫避光儲存備用。

ABTS(批號：20200629，國藥集團化學試劑有限公司)；DPPH(批號：RY393024，安徽博美生物科技有限公司)；表沒食子兒茶素(批號：EGC060919，安徽博美生物科技有限公司)；表兒茶素(批號：EC060919，安徽博美生物科技有限公司)；表兒茶素沒食子酸酯(批號：EB20191225，安徽博美生物科技有限公司)；兒茶素(批號：21042621，上海同田生物技術有限公司)；原花青素A1(批號：21052539，上海同田生物技術有限公司)；原花青素B2(批號：21062924，上海同田生物技術有限公司)；色譜純乙腈、甲醇(國藥集團化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋(金壇大地自動化儀器廠)；真空冷凍干燥機(松源華興科技發展有限公司)；Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)；TBE-300B高速逆流色譜(上海同田生物技術有限公司)；Waters 2998液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 青桑原花青素粗提物制備

稱取一定量青桑葚樣品粉末置于燒杯中，使用60%乙醇作為提取液，料液比1∶20，在40 ℃水浴條件提取90 min，重復提取三次，抽濾得浸提液，再在45 ℃下減壓旋轉蒸發至浸膏狀態。浸膏用水復溶后依次用石油醚、氯仿萃取，去除其脂類、生物堿等雜質。再用乙酸乙酯萃取，萃取過后將所得乙酸乙酯級分在45 ℃條件下旋蒸除去乙酸乙酯[15]，得到浸膏用水復溶，真空冷凍干燥備用。

1.3.2 高速逆流色譜(HSCCC)溶劑系統篩選

適宜溶劑體系的篩選是HSCCC分離中最為復雜和關鍵工作，依據Ito歸納認為[16]，在不知目標組分極性的情況下，根據本文分離物質為乙酸乙酯萃取物，溶劑體系的篩選可以從正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系開始，調整各組成溶劑的體積比。結合溶劑體系的極性和參考相關文獻[17-21]選取了表(1)中各溶劑體系進行HSCCC分離體系篩選。同時利用高效液相法測定各個體系對目標組分的分配系數K，方法如下：根據溶劑體系比例配制溶液，劇烈震蕩后靜置分層，分別取上下相各2 mL，準確稱取5 mg青桑葚粗提物，溶于上下相，搖勻，待兩相分配達到平衡后，將兩相進行分離，然后過0.45 μm濾膜，用HPLC檢測分析，按式(1)和(2)計算目標組分的分配系數K和分離因子(α)，通常在HSCCC溶劑系統中，K值范圍在0.5～2之間最合適。

(1)

(2)

式中：S上表示目標組分在上相中測得的峰面積；S下表示目標組分在下相中測得的峰面積；Ki和Kj(Ki≥Kj)分別代表不同組分在溶劑體系中的分配系數。

1.3.3 HSCCC分離制備

按照“1.3.2”節篩選的最佳溶劑比例組合作為HSCCC溶劑體系。將配好的溶劑體系靜置后分層，上相作為固定性、下相作為流動相，超聲脫氣30 min。進樣前，低溫恒溫槽設定溫度30 °C，先泵入固定相，流速為30 mL/min，待固定相充滿管道后，轉速為正轉850 r/min，當轉速恒定后，以2 mL/min流速泵入流動相，待檢測器出口端流出一定體積流動相且紫外信號穩定，即體系系統達到平衡，開始進樣。準確稱取青桑原花青素粗提物200 mg，用15 mL流動相充分溶解，過0.45 μm有機濾膜，進樣后打開色譜工作站，檢測波長為280 nm，根據高速逆流實驗時，設備得到的色譜流出圖對出峰組分分步收集，粗提物經高速逆流色譜在500 min內分離得到F1、F2、F3、F4，最后用氣泵吹出固定相命名為F5，對收集所得各個組分進行真空冷凍干燥，避光冷藏貯存備用。

1.3.4 HPLC分析檢測

分別準確稱取一定量經“1.3.3”節HSCCC分離所得組分，用甲醇(色譜純)配制成質量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，并配置一定濃度的標準品溶液，過0.45 μm有機濾膜，用于HPLC法對樣品定性分析與純度分析。采用標準品對照法和內標法對樣品進行成分鑒定；依據峰面積歸一法計算所得組分的純度，按式(3)計算樣品純度[22]。

(3)

上式中：Wi為待測組分i的峰面積比例/%；fi為校正因子；Ai為待測組分i的峰面積。

色譜條件：Sun Fire?C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：0.1%甲酸-乙腈，流動相B：0.1%甲酸-水；梯度洗脫：0～6 min，15%A；6～10 min，15%→35%A；10～15 min，35%→45%A；15～20 min，15%A；流速1 mL/min；檢測波長280 nm，柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.5 抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Li[23]的方法并略作修改。分別準確稱取1.0 mg樣品(青桑葚高速逆流組分F1、F2、F3、F4、F5)用甲醇將其配制成不同質量濃度(0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mg/mL)的樣品溶液，在96孔酶標板中每孔中先后加入各組分不同濃度樣品溶液100 μL和0.5 mg/mL DPPH甲醇溶液100 μL，室溫下，暗處反應30 min，517 nm處測定紫外吸光度，記作實驗組Ai；加入樣品溶液和甲醇溶液各100 μL，記作對照組Aj；加入甲醇100 μL和DPPH甲醇溶液100 μL，記作空白組Ao，每組樣品設3組平行組；以同濃度抗壞血酸(Vc)作對比實驗。按式(4)算出DPPH自由基的清除率。

(4)

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

參考Li[24]的方法并略做改動。配置7 mmol/L的ABTS溶液及2.45 mmol/L的過硫化鉀溶液，按1∶1的體積比搖勻混合后常溫避光放置16～24 h，得到ABTS自由基陽離子儲備液。然后，用甲醇稀釋約6倍。取ABTS稀釋液200 μL與100 μL的不同濃度的樣品液混合，室溫、避光條件下反應6 min，立即測定其在734 nm處的吸光度，記作實驗組Ai；加入樣品100 μL和超純水200 μL，記作對照組Aj；加入超純水100 μL和ABTS工作液200 μL，記作空白組Ao，每組樣品設3組平行組；以同濃度抗壞血酸(Vc)作對比實驗；按照公式(5)計算ABTS自由基的清除率。

(5)

1.3.5.3 羥基自由基清除能力測定

采用Fonton反應-水楊酸法測定羥基自由基清除能力。在96孔酶標板中每孔中先后加入試樣和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L硫酸亞鐵溶液及9.79 mmol/L過氧化氫溶液各50 μL[25]。37°C恒溫條件下反應30 min，510 nm處測定吸光度值記為實驗組Ai。加入樣品50 μL和超純水150 μL，記作對照組Aj；加入超純水50 μL和上述三種溶劑各50 μL，記作空白組Ao；以同濃度抗壞血酸(Vc)作對比實驗；每組樣品設3組平行組；按照公式(6)計算羥基自由基的清除率。

(6)

2 結果與分析

2.1 HSCCC溶劑系統的確定

根據青桑葚粗提物的HPLC色譜圖(如圖2)，結合標準品出峰時間(如圖1)并選取粗提物中占比較大物質組分作為目標組分，則選擇了圖2中峰1、2、3和4四個目標化合物色譜峰。

圖1 標準品HPLC圖

圖2 青桑葚粗提物HPLC色譜圖

按照“1.3.2”方法測定不同溶劑體系中目標組分1、2、3、4的分配系數K并計算組分1與組分2和組分3與組分4相對的分離因子α，如表1所示。根據所得目標組分在不同溶劑中的分配系數和分離因子α，并比較具體分離效果，可知當溶劑體系對不同組分的分配系數K接近于1，分離因子α接近1.5時，即選取正己烷-乙酸乙酯-水(1∶20∶20，V/V/V)作為分離青桑葚中原花青素的HSCCC溶劑體系有較優分離效果。

表1 不同溶劑體系中四個目標組分的分配系數和分離因子

2.2 HSCCC分離制備結果

經“2.1”溶劑體系篩選優化，優化前后青桑原花青素粗提物HSCCC分離效果如圖3，優化前溶劑體系為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.17∶12.5∶1∶12.5，V/V/V/V)，固定相保留率為64.28%，100 min左右開始出峰，色譜分離出2個峰，分離效果較差；而經溶劑體系篩選后以正己烷-乙酸乙酯-水(1∶20∶20，V/V/V)作為分離青桑葚原花青素粗提物的HSCCC溶劑體系，體系固定相保留率為64.21%，與優化前相差不大，出峰時間提前約20 min，分離出4個峰，如圖3中優化后譜圖所示。

如圖3中青桑中青桑葚粗提物HSCCC分離效果圖所示，根據分離效果計算出從200 mg青桑原花青素粗提物經HSCCC分離所得各組分的質量和得率分別為F1(28.5 mg，14.25%)、F2(10.43 mg，5.22%)、F3(6.85 mg，3.43%)、F4(10.65 mg，5.33%)、F5(13.65 mg，6.83%)。

圖3 HSCCC分離青桑中原花青素粗提物溶劑優化前后色譜圖

2.3 HPLC檢測分析結果

采用HPLC對青桑葚粗提物經HSCCC分離所得的五個組分(F1、F2、F3、F4、F5)進行液相色譜檢測分析，其結果如圖4分別為HSCCC分離組分F1～F5的液相色譜圖。

圖4 青桑葚粗提物各組分的HPLC色譜圖

由圖可知，HSCCC分離對青桑原花青素粗提物中相近組分有較好分離效果，如圖2中的組分1與組分2，其中組分1在F4中被富集，而組分2主要位于F2。對照表兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、原花青素A1、原花青素B2等標品的HPLC圖(見圖1)，根據保留時間對照標品初步推測定性，采用內標法將標品與樣品混合，根據出峰時間和出峰情況推測判斷樣品中未知峰物質是否為推測的標品物質，再按式(3)計算樣品的純度。

得出F1中峰a、b和c分別為兒茶素(38.54%)、原花青素B2(12.96%)和原花青素A1(9.58%)；F2中峰d為ECG(18.54%)；F3中峰e為原花青素B2(51.10%)；F4中峰f為EGC，純度達到95.05%；F5中峰g為EC，純度達到73.75%。相似結構與性質物質的分離是天然產物分離制備的重難點，通過此高速逆流色譜分離，可將原花青素粗提物液相譜圖中相近出峰物質分離在不同組分中，為后期的單體分離奠定了基礎。

2.4 抗氧化結果分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力分析

DPPH是一種較為穩定的含氮自由基，分子結構簡單，廣泛用于各類天然產物的體外抗氧化活性研究。文中測定的青桑葚粗提物經HSCCC所得五個組分不同質量濃度(0.1～1 mg/mL)對DPPH自由基的清除活性如圖5所示，隨著不同組分樣品濃度的增加，其DPPH自由基的清除能力也逐漸增強，DPPH自由基清除能力各個組分比較：F5>F4>F2>F3>F1>青桑葚粗提物，但差于同濃度Vc，其中F4與F5的DPPH自由基清除率明顯優于其他三個組分，且當兩者濃度大于0.3 mg/mL時，其DPPH自由基清除率大于80%，可能是由于F4、F5純度較高的原因。另外F2較F1好，這與Liu等[26]文中兒茶素類物質清除DPPH自由基的能力：ECG>EC>兒茶素相符。

圖5 不同濃度樣品對DPPH自由基的清除率

2.4.2 ABTS+自由基清除能力分析

ABTS+自由基溶液表現為深藍色，在734 nm處有最大紫外吸收峰。隨著被測物質加入ABTS+自由基溶液后，被測物質中的部分抗氧化成分能與ABTS+自由基發生反應而使藍色褪去，可根據其在734 nm處吸光度變化測定其清除效果。由圖6可以看出經青桑葚粗提物以及經HSCCC分離出的5個組分在0.1～1 mg/mL的濃度范圍內，ABTS+自由基清除能力排序為：Vc>F5>F4>F2>F3>F1>青桑粗提物。其中F5和F4對ABTS+自由基的清除率比其他組分要好，在0.3 mg/mL時清除率已大于90%，但是各組分的清除效果都較同濃度Vc差。

圖6 不同濃度樣品對ABTS+自由基的清除率

2.4.3 羥基自由基清除能力分析

由圖7知羥基自由基清除能力排序大致為：F1>F5>Vc>F4>F2>青桑粗提物>F3，F1、F5和Vc在0.1～1 mg/mL不同濃度范圍內，隨著濃度增大，羥自由基清除率增大，且清除能力F1>F5>Vc>F4；其中F1組分羥自由基清除率遠大于Vc，可能是F1組分體系共同作用的結果；F2、F3和青桑葚粗提物在較高濃度時，其清除率呈現負值情況，代表不但不能有效清除羥基自由基，反而能促進它的生成，這可能是由于被測物質混合物體系中含有某種物質可以產生羥基自由基，但其具體機理與原因需要進一步研究。

圖7 不同濃度樣品對羥基自由基的清除率

3 結論

以青桑葚為原材料，經本實驗條件下提取、脫脂除雜、萃取富集獲得粗提物，HSCCC分離純化最佳溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-水(1∶20∶20，V/V/V)，200 mg青桑原花青素粗提物經HSCCC分離5個組分得率分別F1(28.5 mg)、F2(10.43 mg)、F3(6.85 mg)、F4(10.65 mg)、F5(13.65 mg)，各組分中含有兒茶素、原花青素B2、原花青素A1等物質，其中F4中含表沒食子兒茶素，純度達到95.05%；F5中表兒茶素，純度達到73.75%。分離所得各個組分都具有一定的抗氧化活性，以Vc作為對照，DPPH自由基清除能力：Vc>F5>F4>F2>F3>F1>青桑葚粗提物；ABTS+自由基清除能力：Vc>F5>F4>F2>F3>F1>青桑葚粗提物；羥基自由基清除能力：F1>F5>Vc>F4>F2>青桑葚粗提物>F3。HSCCC制備量大、色譜柱無填料，本實驗中粗提物經1次分離可獲得5個組分，且部分組分具有較高純度的單體物質和較強的抗氧化活性。文章研究內容為原花青素的生產開辟了新思路，也為青桑葚中原花青素類物質的藥用功效研究提供一定的理論支持。