一種改良的土壤線蟲分離方法的效果評(píng)估

陳玉秀，王婭娟，張 發(fā)，趙成法*

（1.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

土壤線蟲是指生活史的某個(gè)階段或終生生活于土壤中的線蟲，是土壤中最為豐富且生態(tài)功能最重要的動(dòng)物之一〔1-2〕。根據(jù)其生活方式差異可分為腐生線蟲、食微生物線蟲和寄生線蟲。這類動(dòng)物具有個(gè)體小、種類多、繁殖快、比表面積大和代謝快的特點(diǎn)〔2-3〕，在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)等生態(tài)過程中扮演著重要的角色〔1，4-5〕，同時(shí)由于對(duì)土壤因子的改變極為敏感，其多樣性和豐富度不僅是衡量整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)狀況的重要指標(biāo)，也是農(nóng)田土壤健康與否的主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)之一〔3，6-7〕。土壤植物寄生線蟲就危害程度而言僅次于植物病原微生物的病原體，也是眾多科研工作者研究的重點(diǎn)對(duì)象〔8-10〕。如何準(zhǔn)確、快速地將線蟲從土壤中分離出來(lái)是相關(guān)研究不可避免的基礎(chǔ)問題，一個(gè)可靠、高效的分離方法是相關(guān)研究成功與否的關(guān)鍵。

目前常用的土壤線蟲分離方法主要有淺盤法、貝爾曼漏斗法和LUDOX TM 懸浮法等〔11-12〕。其中LUDOX TM 懸浮法雖具有較好的分離率，但操作繁瑣、成本較高，很難大規(guī)模使用。淺盤法操作簡(jiǎn)便、成本較低，但因其僅利用線蟲的親水性進(jìn)行分離，導(dǎo)致分離率較低，難以用于精確的定量研究〔13〕。與淺盤法相比，貝爾曼漏斗法不僅利用線蟲的親水性使之從土壤中游離出來(lái)，而且在重力作用下下沉到收集管，使分離率有所提高，是目前使用最多的方法〔13〕，但該分離方法依然無(wú)法滿足定量研究的需要〔14〕。

本研究在改良貝爾曼漏斗法〔15-16〕（簡(jiǎn)稱“改良法1”）的基礎(chǔ)上再次進(jìn)行改良（簡(jiǎn)稱“改良法2”），并對(duì)線蟲分離率等進(jìn)行評(píng)估，旨在探索更簡(jiǎn)便、高效和低成本的土壤線蟲分離方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料高壓蒸氣滅菌鍋（致微（廈門）儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；體式顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；微量移液器（熱電（上海）儀器有限公司）；培養(yǎng)皿（上海五一玻璃儀器廠）；30、35、120、500 目（φ=65 mm）圓形不銹鋼濾網(wǎng)（紹興市上虞區(qū)豪泉篩具廠）；三角漏斗（φ＝90 mm）、錐形瓶、燒杯（上海申立玻璃儀器銷售有限公司）；瓊脂、葡萄糖、液體硅膠（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）。

全齒復(fù)活線蟲（Panagrellus Redivivus）由大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院種質(zhì)資源庫(kù)提供；土壤采集自大理大學(xué)后山茶園，除去大顆粒后，取部分進(jìn)行間歇式高壓蒸氣滅菌處理（121 ℃、30 min）后備用。

1.2 方法

1.2.1 線蟲及土壤處理方法 全齒復(fù)活線蟲經(jīng)燕麥培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)6 d 后，采用貝爾曼漏斗法分離備用。

人工添加定量線蟲土壤樣品：土壤經(jīng)高壓滅菌，去除原有線蟲。稱取土壤樣品15 份，每份10 g，體視顯微鏡下用移液器在每份樣品中準(zhǔn)確加入150條線蟲。

自然農(nóng)田土壤樣品（含不定量線蟲）：稱取未滅菌土壤樣品15 份，每份5 g。

1.2.2 不同分離方法線蟲分離率的測(cè)定 用人工添加定量線蟲的土壤樣品，按以下不同方法分離土壤線蟲，記數(shù)并計(jì)算分離率，每種方法重復(fù)3 次。

線蟲分離率= （分離出的線蟲數(shù)/總線蟲數(shù)）×100%。

淺盤法：參照毛小芳等〔13〕報(bào)道的土壤線蟲分離方法，并在其基礎(chǔ)上將淺盤改為培養(yǎng)皿，篩網(wǎng)和擦鏡紙換為1 層80 目尼龍紗網(wǎng)和2 層擦鏡紙。

貝爾曼漏斗法：按文獻(xiàn)〔16〕的土壤線蟲分離方法進(jìn)行分離。

LUDOX TM 懸浮法〔14〕：將土壤樣品放入燒杯加入100 mL 沸水，冷卻后倒入35 目篩網(wǎng)（下接120目、500 目篩網(wǎng)）組合中，用流水緩慢沖洗至水流澄清。依次移除35 目和120 目篩網(wǎng)后，再用流水將500 目篩網(wǎng)內(nèi)物質(zhì)緩慢沖洗至流水澄清，最后用密度為1.18 g/mL 的硅膠溶液將500 目篩網(wǎng)內(nèi)的物質(zhì)完全沖至500 mL 燒杯中，攪拌均勻后靜置1.5 h，將燒杯中的上清液再次倒回500 目篩網(wǎng)，留在篩網(wǎng)上的物質(zhì)用流水完全沖至樣品瓶中即為土壤線蟲濾液。重復(fù)3 次操作后將線蟲濾液混合并計(jì)數(shù)。

改良法1：參照鐘雪超〔16〕報(bào)道的土壤線蟲分離方法，在該方法的基礎(chǔ)上修改而成，漏斗與紗網(wǎng)間增加不銹鋼網(wǎng)篩以支撐樣品。

改良法2：由改良法1 進(jìn)一步調(diào)整改良。主要區(qū)別在于：（1）在乳膠收集管末端注入1~2 mL 含0.04 g/mL 葡萄糖的瓊脂以定向吸引線蟲；（2）將整個(gè)裝置置于27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中以增強(qiáng)線蟲的活力〔17〕。裝置見圖1。

圖1 貝爾曼漏斗改良法2 操作裝置

1.2.3 不同分離方法測(cè)定自然農(nóng)田土壤線蟲分離的數(shù)量 按“1.2.2”項(xiàng)下方法分離和測(cè)定含不定量線蟲的自然農(nóng)田土壤中線蟲的數(shù)量，每種方法重復(fù)3 次。

1.2.4 不同分離方法分離時(shí)長(zhǎng)與成本估算 記錄本研究的3 位參與者獨(dú)立完成1 份土壤樣品處理的實(shí)際操作時(shí)長(zhǎng)即為操作耗時(shí)。分離成本為一次性耗材（擦鏡紙、葡萄糖、瓊脂、液體硅膠等）成本，按照市場(chǎng)價(jià)進(jìn)行估算。

1.3 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)用Excel 軟件進(jìn)行整理，用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分離方法線蟲分離率以人工添加定量線蟲的土壤樣品為實(shí)驗(yàn)材料，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 懸浮法的分離 率 分 別 為（61.77±2.20）%、（72.44±1.37）%、（80.66±1.09）%、（94.89±2.27）%、（91.11±2.20）%。與其他4 種方法相比，改良法2 對(duì)線蟲的分離率分別提高了33.12%、22.45%、14.23%和3.78%。改良法2與淺盤法、貝爾曼漏斗法和改良法1 相比，線蟲分離率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 不同分離方法線蟲分離數(shù)量以自然農(nóng)田土壤樣品（含不定量線蟲）為實(shí)驗(yàn)材料，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 懸浮法分離得到的線蟲數(shù)量分別為（53.00±3.27）、（71.00±2.05）、（83.00±1.63）、（92.00±2.05）、（92.00±3.30）條。與淺盤法、貝爾曼漏斗法和改良法1 等三種方法相比，改良法2 分離出的線蟲數(shù)量分別增加了39、21、9 條，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 不同分離方法的耗時(shí)與成本操作單份樣品時(shí)，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1 和改良法2 均可在5 min 內(nèi)完成，LUDOX TM 懸浮法則需30~45 min；在分離成本方面，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1 和改良法2 分離1 份樣品的成本均在1.0 元以內(nèi)，而LUDOX TM 懸浮法的分離成本為7.5 元。結(jié)合線蟲分離率，改良法2 在操作耗時(shí)與成本方面具備更多優(yōu)勢(shì)。見表1。

表1 不同分離方法的操作耗時(shí)和成本

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，改良法2 和LUDOX TM 懸浮法的線蟲分離率無(wú)顯著差異，但顯著高于其他3 種方法（P<0.01）。LUDOX TM 懸浮法是蔗糖懸浮法的改進(jìn)〔18〕，其分離原理相似，均利用蟲體與溶液的密度差進(jìn)行分離〔15〕，但LUDOX TM 懸浮法很好地克服了高滲溶液易使蟲體脫水變形，不利于后續(xù)線蟲鑒定的缺點(diǎn)〔11，14，19〕。與改良法2 相比，LUDOX TM懸浮法在過篩懸浮前需加入熱水，通過高溫殺死土壤中的線蟲，因此該方法不能區(qū)分土壤中的線蟲活體與死體，對(duì)于需計(jì)數(shù)活體線蟲或需做后續(xù)活體線蟲實(shí)驗(yàn)的研究不適用，加之該方法較為繁瑣，操作耗時(shí)和成本較高，不宜大規(guī)模使用。而改良法2 具有操作簡(jiǎn)便、操作耗時(shí)少、成本低且分離出的線蟲大部分為活體的優(yōu)點(diǎn)，是LUDOX TM 懸浮法較好的替代方法。

貝爾曼漏斗法利用線蟲親水性使之從土壤中游離出來(lái)，然后在重力的作用下下沉到收集管中而達(dá)到分離線蟲的目的。該方法具有操作簡(jiǎn)便、分離出的線蟲懸液雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，是眾多線蟲研究者最常用的方法〔12，14〕。但由于該方法在操作時(shí)擦鏡紙等過濾層會(huì)緊貼于漏斗內(nèi)壁，增加了漏斗壁上的線蟲存留，不利于線蟲的下沉。因此對(duì)該方法進(jìn)行了改良，產(chǎn)生了改良法1。該方法以圓形不銹鋼篩網(wǎng)支撐樣品，一方面減少了漏斗壁上的線蟲存留，另一方面增加了樣品與水的接觸面積，從而提高了線蟲分離率〔15-16〕。在此基礎(chǔ)上，基于24~30 ℃是線蟲活力最強(qiáng)的溫度的理論〔17〕和線蟲的趨化特性，改良法2 在收集管的末端加入了葡萄糖瓊脂定向吸引線蟲，同時(shí)將整個(gè)分離裝置置于27 ℃環(huán)境下增加線蟲的活力，使之更快地從土壤中游離出來(lái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，改良法2 雖然略微增加了操作耗時(shí)和成本，但對(duì)線蟲的分離率明顯高于改良法1，是改良法1 良好的替代方法。

基于改良法2 的分離原理，由于不同類型的線蟲對(duì)物質(zhì)的趨化性不同，當(dāng)需要分離某一特定類群時(shí)需對(duì)添加的趨化物做一定的調(diào)整。如CuSO4對(duì)甜菜孢囊線蟲的二齡幼蟲有極強(qiáng)的吸引作用〔20〕；秀麗隱桿線蟲對(duì)氯化鈉或異戊醇均有趨向性，且化學(xué)趨向性隨著溫度的增加而增強(qiáng)〔21〕。因此，在實(shí)際操作中可根據(jù)需求，選擇相應(yīng)的趨化物來(lái)提高對(duì)特定線蟲的分離率。

4 結(jié)論

改良法2 是在改良法1 基礎(chǔ)上改進(jìn)得到的，其繼承了改良法1 操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，在穩(wěn)定環(huán)境溫度提高線蟲游離速度的基礎(chǔ)上，通過趨化物的定向吸引使線蟲分離率得到提高。無(wú)論是基于分離率還是操作耗時(shí)及成本方面的考量，改良法2 均具備明顯優(yōu)勢(shì)，有較高應(yīng)用價(jià)值。