一種比色/熒光增強型碳點基納米探針用于環境中苯硫酚的高選擇性檢測

王 芹，劉智峰，李利華，黃 佩，孫艷麗，葛 舉，張晟瑞

（陜西理工大學化學與環境科學學院，陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西漢中 723000）

1 引言

作為一種重要的工業原料，苯硫酚（Thiophenol,PhSH）可用于化學中間體、染料和農藥的制備。然而，長期接觸PhSH 對人體健康的危害很大，可能會引起中樞神經系統損傷、惡心、肌肉無力、頭痛、昏迷甚至死亡[1]。此外，環境中過量的PhSH 會對其他動物和水生生物造成危害。鑒于此，PhSH 已被美國環境保護署列為最重要的環境污染物之一。傳統檢測PhSH 的方法，如氣相色譜-質譜聯用[2]和高效液相色譜[3]，具有良好的準確性和重現性，但具有成本高、檢測時間長等問題，制約了它們在環境樣品中快速檢測的實際應用。因此，開發一種簡單、快速、高選擇性檢測PhSH的方法在環境科學領域具有重要意義。

熒光探針具有選擇性和靈敏度高、操作方便等優點[4-5]，在PhSH 的檢測中具有廣闊的應用前景。然而，由于PhSH 和生物硫醇具有相似的物理和化學性質，開發可區分PhSH 和生物硫醇的熒光探針極具挑戰性[6]。Wang 課題組以2,4 -二硝基苯磺酰胺（2,4-dinitrobenzenesulfonyl,DNS）為識別基團開發了首個可特異性區分PhSH 和生物硫醇的熒光探針[7]。此后，科研工作者以2,4-二硝基苯磺酰胺作為識別基團、半花菁[8]或羅丹明[9]等染料作為報告基團，開發了許多熒光增強型探針。然而，它們的熒光團大多數為有機小分子，光穩定性較差。因此，尋找較好的熒光團是一項長久且關鍵的工作。熒光碳點（Carbon dots,CDs）具有合成步驟簡單、光穩定性高、毒性低等特點[10-14]。近年來，很多課題組以CDs 為熒光團，開發了很多基于CDs 的熒光探針[15-17]。然而，可檢測環境樣品中PhSH 的CDs 基熒光納米探針的開發還處于初級階段。因此，開發一種高選擇性、快速響應的CDs基納米熒光探針用于環境中PhSH 的檢測是一個亟待解決的問題。

在前期工作中，我們以黃綠色熒光CDs（Y-GCDs）（量子產率為28.6%）為熒光團、DNS 為識別基團，成功構建了一個檢測生物體內硒代半胱氨酸（Selenocysteine,Sec）的CDs 基納米探針（CDDNS）[18]。在該工作中，我們并未探討CD-DNS 檢測環境中PhSH 的應用潛力?？紤]到PhSH 和Sec具有相似的物理化學性質（PhSH 和Sec 的pKa 值分別為6.5 和5.2，分子結構中均含有巰基），我們設想將CD-DNS 應用于環境中PhSH 的檢測。結果表明探針CD-DNS 對PhSH 表現出明顯的比色/熒光增強反應，且反應速度非常快（反應時間為4 min）。CD-DNS 溶液本身幾乎沒有熒光，加入PhSH 后，熒光強度增強，且顏色發生顯著變化（從無色變成黃色），很容易用肉眼觀察到，這意味著CD-DNS 可用于PhSH 的比色/熒光雙模式檢測。該納米熒光探針對PhSH 的檢測不受其他干擾物質的影響，具有良好的選擇性。此外，CD-DNS 可用于環境水樣中PhSH 的測定（回收率為94.0%～101.8%），并可制備成試紙條實現PhSH 的半定量可視化檢測，結果令人滿意。

2 實驗

2.1 材料和儀器

間氨基酚（m-aminophenol,mAP）、PhSH、2,4-二硝基苯磺酰氯、L-半胱氨酸（L-cysteine,L-Cys）、高半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）購自阿拉丁有限公司（上海，中國)，其他所有試劑均為分析純。

傅立葉變換紅外（Fourier transform infrared,FT-IR）光譜在Vertex 70 FT-IR 光譜儀（Bruker，德國）上進行采集。X 射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）在ESCALAB 250Xi 上得到。使用日立FL-4600 熒光分光光度計和島津UV-2600 紫外分光光度計分別測量熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。溶液pH 值通過Sartorius PB-10 pH 計測量。

2.2 Y-G-CDs 制備

向0.1 gmAP 的10 mL C2H5OH 溶液中加入15 μL 濃鹽酸及5 μL 濃硝酸，然后將溶液轉移到25 mL 聚四氟乙烯內襯的不銹鋼高壓釜中。首先，180 ℃下加熱12 h，得到紅褐色懸浮液。然后，以CH2Cl2/ CH3OH（5∶1，V/V）作為洗脫劑，柱色譜純化粗產物，最終得到純化的Y-G-CDs 樣品。

2.3 CD-DNS 制備

將20 mg Y-G-CDs 加入到含有100 μL 三乙胺和2 mL DMF 的30 mL CH2Cl2溶液中，逐滴加入2,4-二硝基苯磺酰氯溶液（200 mg 溶于6 mL 無水CH2Cl2中），室溫下反應2 h。隨后，水洗、無水Mg-SO4干燥、過濾并進行低壓蒸餾。粗產物利用柱色譜分離，洗脫劑為CH2Cl2/CH3OH（10∶1，V/V），旋干后得到深棕色固體CD-DNS。

2.4 不同pH 值緩沖溶液配制

pH 值在4.9～ 9.2 范圍內的緩沖溶液分別由磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 值范圍為2.2～8.0）和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 值范圍為8.5～ 9.2）制備得到。

2.5 探針CD-DNS 對分析物的光譜響應

準確稱取10 mg 的探針，用丙酮溶解，并定容至10 mL，得到1 mg/mL CD-DNS 儲備液。將CDDNS 溶液（100 μL,1 mg/mL）、約4 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和不同體積的PhSH 原液（1 mmol/L）加入到10 mL 比色管中，最后用PBS 稀釋至5 mL。充分混合后，記錄熒光和紫外-可見吸收光譜。λex/λem=450/520 nm，激發和發射光的狹縫寬度均為5 nm。

2.6 CD-DNS 法測定環境水樣中的PhSH

采用標準添加法驗證CD-DNS 對環境水樣中PhSH 的檢測能力。以自來水（本實驗室）、湖水（陜西理工大學校園湖水）和河水（漢江漢中段）3個實際環境樣品為研究對象，分別采集了3 個50 mL 的樣品。水樣在試驗前利用孔徑為0.22 μm的水相微孔濾膜進行過濾，用PBS 緩沖液調節pH值為7.8。將探針和不同濃度（0，1，2，4 μmol/L）的PhSH 原液加入等分水樣中，室溫孵育4 min，記錄溶液的熒光強度。λex/λem=450/520 nm，激發和發射光的狹縫寬度均為5 nm。

3 結果與討論

3.1 CD-DNS 對PhSH 響應的可行性

首先，我們利用加入PhSH 前后CD-DNS 的熒光和紫外-可見吸收光譜的變化來驗證CD-DNS檢測PhSH 的可行性。如圖1 所示，游離的CDDNS 幾乎沒有熒光，且440 nm 處的紫外吸收強度很弱。加入PhSH 后，探針CD-DNS 溶液在520 nm 處的熒光強度隨著PhSH 的加入而增加（365 nm 紫外燈照射下，溶液顏色由無色變為黃綠色），而且，探針在440 nm 波長下的紫外吸收強度也顯著增強（日光燈照射下，溶液顏色由無色變為黃色）。實驗結果表明CD-DNS 具有比色/熒光雙信號檢測PhSH 的能力。此外，室溫下，CD-DNS 儲備液具有很好的穩定性，36 h 內其熒光強度不會發生變化（圖S1），而且CD-DNS 溶液放置較長時間后，其對PhSH 的響應效果和發光顏色沒有明顯改變（圖S2）。

圖1 探針（20 μg/mL）與PhSH（0，5 μmol/L）在20 mmol/L 緩沖液（pH=7.4，25 ℃，λex=450 nm）中反應后的熒光發射光譜（a）和紫外-可見吸收光譜（b），插圖分別為探針（?。┡c探針+PhSH（ⅱ）的熒光圖像（（a）中插圖）和可見光圖像（（b）中插圖）。Fig.1 Fluorescence emission spectra（a）and UV-Vis absorption spectra（b）of the probe（20 μg/mL）reacted with PhSH（0，5 μmol/L）in 20 mmol/L buffer solution（pH=7.4，25 ℃，λex=450 nm）.Insets are fluorescent images（inset in（a））and visible light images（inset in（b））of probe（ⅰ）and probe +PhSH（ⅱ）respectively.

接下來，我們分析了探針與PhSH 的響應機理。根據前人的報道結果可知當識別基團為DNS 時，該探針可選擇性區分PhSH 和生物硫醇[7]。因此，本工作擬利用縮合反應，將識別基團2,4-二硝基苯磺酰氯鍵合在Y-G-CDs 表面得到可選擇性檢測PhSH 的探針CD-DNS。運用XPS 和FT-IR 對Y-G-CDs 的表面組成和化學狀態進行表征，說明Y-G-CDs 的表面含有—OH 和—NH2官能團（圖S3）[18]。同時，利用XPS 和FTIR 對探針CD-DNS 的元素組成進行表征[18]。與Y-G-CDs 相比，CD-DNS 包含一 個新元素（S2p，164 eV）。在高分辨譜中，N1s 的XPS 數據分析顯示硝基N 的含量顯著增加。此外，CD-DNS 的FT-IR 光譜表明CD-DNS 含有—NO2（1 539 cm-1和1 345 cm-1）和—SO2—（1 386 cm-1和1 193 cm-1）（圖S4）。綜上所述，DNS 被成功連接到了Y-G-CDs 表面，得到CDs 基納米探針CD-DNS。由于Y-G-CDs 的表面狀態發生變化，CD-DNS 自身幾乎沒有熒光，最大吸收波長為355 nm，與Y-G-CDs 相比藍移了85 nm（圖1）。加入PhSH后，探針在520 nm 和440 nm 處分別出現新的熒光發射峰和紫外-可見吸收峰，且位置與Y-GCDs 的相一致。實驗結果表明，CD-DNS 可與PhSH 發生親核取代反應，2,4-二硝基苯磺酰胺鍵斷裂，釋放出熒光團（圖2）。因此Y-G-CDs 的熒光發射和紫外吸收恢復，最終實現PhSH 的高選擇性檢測。

圖2 CD-DNS 檢測PhSH 機理示意圖Fig.2 Schematic diagram of mechanism for sensing of PhSH by CD-DNS

3.2 檢測條件優化

為獲得檢測PhSH 的最佳條件，本文采用單因素試驗法考察了pH 值對反應的影響。如圖3（a）所示，當添加PhSH 時，在4.9～ 9.2 的pH 范圍內，探針溶液在520 nm 處的熒光強度先增大后減小，pH=7.8 時達到最大值，這是由于強酸條件不利于探針與PhSH 間的親核取代反應，而堿性條件下Y-G-CDs 的熒光強度較弱的原因[18]。因此，我們選擇7.8 為最佳反應pH 值。此外，我們測定了CD-DNS 在加入PhSH 后，探針在440 nm處吸光度隨時間的變化。如圖3（b）所示，CDDNS 與PhSH 反應迅速，當反應時間為4 min 時，反應基本結束，反應速度快，可降低氧化，提高PhSH 檢測的準確性。因此，CD-DNS 對PhSH 的響應時間控制在4 min。

圖3 在緩沖溶液（20 mmol/L，λex=450 nm）中，CD-DNS（20 μg/mL）對PhSH（5 μmol/L）的pH 依賴性熒光響應（a）和隨時間變化的吸收響應（b）。Fig.3 pH-dependent fluorescence（a）and time-coursed absorption responses（b）of CD-DNS（20 μg/mL）towards PhSH（5 μmol/L）in buffer solution（20 mmol/L，λex=450 nm）

3.3 CD-DNS 對PhSH 的響應

在最佳條件下，我們測定了探針與不同濃度的PhSH 反應后的熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。如圖4（a）所示，CD-DNS 的熒光強度隨PhSH濃度增加而增大，且它們之間呈良好的線性關系，線性范圍為0～5 μmol/L，檢測限為5.9 nmol/L。線性回歸方程為：Y=196.95X+63.34(r=0.997 0)，Y為CD-DNS 的熒光強度，X為PhSH 的濃度（圖4（b））。此外，CD-DNS 在440 nm 處的紫外吸收隨濃度的增加而逐漸增大（圖S5A），線性回歸方程為：Y=0.0574X+0.0888(r=0.9973)，Y為CDDNS 的吸光度，X為PhSH 的濃度（圖S5（b）），檢測限為105 nmol/L。這些結果表明，CD-DNS 可實現PhSH 含量的比色/熒光雙模式檢測。

圖4 （a）在緩沖溶液（20 mmol/L，pH=7.8，λex=450 nm）中，加入不同濃度（0～ 5 μmol/L）PhSH 時，CD-DNS 的熒光發射光譜；（b）CD-DNS 在520 nm 處的熒光強度與不同濃度PhSH 的線性關系。Fig.4 （a）Fluorescence emission spectra of CD-DNS with different concentrations（0-5 μmol/L）of PhSH.（b）The linear relationship between fluorescence intensity of CD-DNS at 520 nm and PhSH at different concentrations.

3.4 探針對PhSH 的選擇性

在復雜的生物和環境樣品中，一種新型熒光探針對分析物的選擇性響應非常關鍵。因此，我們通過觀察CD-DNS 對不同陽離子（Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+、Ag+、Ba2+、Cd2+，濃度均為500 μmol/L）、陰離子（NO3-、SO42-、CO32-、SO32-、F-、Cl-、Br-、SCN-，濃度均為500 μmol/L）、氨基酸（Ala、Trp、Leu、Phe、Thr，濃度均為500 μmol/L）、生物硫醇（Cys、Hcy、GSH，濃度均為500 μmol/L）和PhSH（5 μmol/L）的熒光強度和吸光度響應來評價其對PhSH 的選擇性。如圖5 所示，除Cys、Hcy 和GSH 引起探針較弱的比色/熒光強度增強外，其他分析物沒有引起探針任何比色/熒光信號的變化。相比之下，CD-DNS 在PhSH 存在下表現出明顯的比色/熒光增強。結果表明，CD-DNS 可用于樣品中PhSH 的高選擇性檢測。

圖5 在緩沖溶液（20 mmol/L，pH=7.8，λex=450 nm）中，CD-DNS（20 μg/mL）在不同離子、氨基酸、PhSH 存在下的熒光強度（a）和吸光度（b）。Fig.5 Fluorescence intensity（a）and absorbance（b）of CDDNS（20 μg/mL）in the presence of different ions，amino acids and PhSH in buffer solution（20 mmol/L，pH=7.8，λex=450 nm）.

3.5 環境水樣中PhSH 的檢測

由于PhSH 對環境具有很高的毒性，因此對環境水樣中的PhSH 進行監測是必不可少的。本文采用標準添加法驗證CD-DNS 測定環境自來水、湖水和漢江水樣中PhSH 濃度的能力，證實其在環境科學中的實用價值。所有的水樣都先過濾，調節pH 值至7.8。向這些水樣中添加不同濃度的PhSH（0，1，2，4 μmol/L），然后加入CD-DNS，反應4 min 后進行檢測。如表1 所示，回收率在94.0%～ 101.8%之間。為了進一步考察這個方法的實用性，我們運用試紙條來檢測水樣中的PhSH。首先，將濾紙浸泡在含有1 mg/mL CD-DNS的丙酮溶液中，在空氣中干燥之后，形成試紙條。然后，在室溫下，將該試紙條放入不同濃度的PhSH溶液中，反應4 min 后，取出在空氣中干燥，觀察顏色變化。如圖6 所示，隨著PhSH 溶液濃度的增加，在日光燈下，試紙條的顏色從淺黃色逐漸變化到深黃色；而在365 nm 紫外光照射下，試紙條顏色由無色逐漸變成亮黃綠色。以上結果表明CD-DNS擁有檢測實際環境樣品中PhSH 的能力。

表1 CD-DNS 檢測環境水樣中的PhSH（n=3）Tab.1 Detection of PhSH in environmental water samples by CD-DNS（n=3）

圖6 用CD-DNS 制作的試紙檢測PhSH 的顏色變化Fig.6 Color alteration of CD-DNS-coated filter paper after immersing into different concentrations of PhSH

最后，將CD-DNS 檢測P hSH 的特性與其他已發表的P hSH 熒光探針相比較。結果表明，CDs 基納米探針CD-DNS 具有合成步驟簡單、選擇性高、水溶性好、檢出限低的優點（表S1）[19-22]，但該方法的線性范圍還需在后續的工作中繼續改進。

4 結論

本工作成功地將CDs 基納米探針CD-DNS 應用于環境樣品中PhSH 的比色/熒光雙模式檢測。加入PhSH 后，該探針表現出顯著的顯色反應和熒光“開啟”響應，具有反應速度快（4 min）、選擇性好的特點。此外，探針CD-DNS 可成功用于監測環境水中PhSH 的含量，回收率較好（94.0%～101.8%），且可制備成試紙條實現PhSH 的半定量可視化檢測。該實驗方法為設計構建新型CDs 基納米探針提供了新思路，拓寬了納米探針在環境樣品中的應用前景。

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