急性心肌梗死患者外周血NO-PGC1α線粒體生物合成通路相關基因的表達及其臨床意義*

壯婷，楊帆

（常州市第二人民醫院 急診科，江蘇 常州 213000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是心血管疾病死亡的主要原因，多發于老年人，具有發病急、進展快的特點[1-2]。早期有效預測AMI 的發生、盡早開展防治措施對降低AMI 死亡風險意義重大，但目前臨床缺乏新型早期有效預測AMI 發生的高效、客觀的生化指標。已有報道顯示，血清外連素[3]、高敏C 反應蛋白[4]與多數AMI 發生相關，但目前臨床預測AMI 仍不理想[5]，迫切需求更多可安全、高效、客觀地預測AMI 發生的生化標志物，以便指導早期治療，改善預后。

AMI 患者冠狀動脈供血不足，導致心肌細胞出現不可逆轉損傷。近期有研究顯示，心肌細胞損傷與過量活性氧有關[6]。一氧化氮-過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1α（nitric oxideperoxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α, NO-PGClα）線粒體生物合成通路蛋白是線粒體生物發生的重要蛋白質，NO-PGC1α 可通過促進線粒體氧化代謝，生成活性氧[7]。線粒體功能生物合成障礙與多種心血管疾病有關[8-9]。一氧化氮NO 作為維持心血管內環境穩定的重要分子之一，NO 信號通路分子精氨酸酶2（arginase 2,Arg2）、一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase 1,NOS1）可通過競爭底物L-精氨酸調節NO，生成的NO 可能通過調節NOPGC1α 表達調控線粒體生物合成，影響AMI 的發生。目前國內尚未見外周血NO-PGC1α 線粒體生物合成通路相關基因表達與AMI 發生關系的報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年5 月—2021 年6 月常州市第二人民醫院收治的AMI 患者103 例為AMI 組。其中男性59 例，女性44 例；年齡45～80 歲，平均（63.84±7.01）歲。另取同期該院健康體檢者69 例為對照組,男性36 例，女性33 例；年齡47～80 歲，平均（61.95±6.89）歲。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1納入標準①AMI 組符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[10]AMI 診斷標準，對照組經病史、心電圖、心肌標志物及冠狀動脈造影等證實無心肌梗死病變；②AMI 組發病至入院時間＜12 h。1.2.2 排除標準 ①伴有血管畸形病變、代謝性腦病、中樞神經系統感染、顱內器質性病變；②近期使用糖皮質激素、免疫抑制劑、抗凝藥物等；③伴有外周神經疾病、精神性疾病、認知功能障礙者；④肝、腎等重要臟器功能嚴重障礙；⑤伴有腦卒中史、嚴重免疫缺陷、傳染性疾病、血液系統疾病、惡性腫瘤、胸部外傷史、血液透析史等；⑥妊娠及哺乳期女性；⑦近期出現急性感染；⑦依從性差；⑧無法配合完成本研究者。

1.3 資料收集

收集兩組基本資料及AMI 入院治療前、對照組體檢時生化指標，包括性別、年齡、體質量指數（body mass index, BMI）、基礎疾病、吸煙史、飲酒史、甘油三酯（Triglycerides, TG）、總膽固醇（total cholesterol, TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase, AST）、總膽紅素、血肌酐、尿酸、尿素氮、血乳酸、白細胞計數（white blood cell, WBC）、血小板計數（Platelets,PLT）、纖維蛋白原、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、脂蛋白相關磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2, LP-PLA2）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ）。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA的表達

AMI 組入院治療前、對照組體檢時抽取靜脈血液5 mL 貯存于肝素抗凝管中，采用QIACEN RNeasy Mini 試劑盒提取血中總RNA，microRNA Isolation Kit 試劑盒（美國Bio-Rad 公司）分離RNA，Superscript RT Kit 試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司）逆轉錄成cDNA，SYBR Green PCR master Mix 試劑盒（大連寶生生物工程公司有限公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR），在PCR 儀上（美國ABI 公司7500 Fast Real-Time PCR System PCR）測定外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA的表達[11]。反應體系20 μL：基因組DNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、PCR 緩沖液10 μL、蒸餾水8 μL。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 個循環。以Ct 值為基礎，2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量。內參選用GAPDH，qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 冠狀動脈病變狹窄程度積分

AMI 組患者入院后進行冠狀動脈造影，采用Gensini 積分[12]系統評價患者冠狀動脈血管病變狹窄程度。Gensini積分≤40分為輕度狹窄，＞40分～＜80分為中度狹窄，≥80 分為重度狹窄。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線；影響因素的分析采用多因素Logistic 回歸模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AMI 組不同病情嚴重程度患者外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相對表達量比較

103 例AMI 患者中，輕度狹窄患者26 例（25.24%），中度狹窄患者59 例（57.28%），重度狹窄患者18 例（17.48%）。

輕、中、重度狹窄組外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=10.156、28.529 和17.580，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：重度狹窄組外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量高于中、輕度狹窄組（P＜0.05）；中度狹窄組NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量高于輕度狹窄組（P＜0.05）。見表2。

表2 AMI組不同病情嚴重程度患者外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相對表達量比較 （x±s）

2.2 AMI組與對照組臨床資料比較

AMI 組與對照組的性別、年齡、BMI、基礎疾病、吸煙史、飲酒史、TG、TC、HDL-C、ALT、AST、總膽紅素、血肌酐、尿酸、尿素氮、血乳酸、WBC、PLT、MMP-9 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。AMI 組與對照組的LDL-C、纖維蛋白原、LP-PLA2 及NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），AMI組LDL-C、纖維蛋白原、LP-PLA2 及NO-PGC1α、NOS1、 Arg2 mRNA 相對表達量高于對照組。見表3。

表3 AMI組與對照組臨床資料比較

2.3 影響AMI發生的多因素Logistic分析

以AMI 為因變量（否= 0，是= 1），LDL-C、纖維蛋白原、LP-PLA2 及NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量為自變量（上述計量資料自變量賦值為連續變量），進行多因素Logistic 回歸分析。結果顯示：NO-PGC1α mRNA [O^R=3.873（95% CI：1.594，9.412）]、NOS1 mRNA [O^R=4.267（95% CI：1.756，10.371）]、Arg2 mRNA [O^R=4.518（95% CI：1.859，10.979）]是影響AMI 發生的獨立因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響AMI發生的多因素Logistic回歸分析參數

2.4 外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 預測AMI發生的價值

ROC 曲線結果顯示，外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 及3 者聯合預測AMI 發生的敏感性分別為70.87%、71.84%、75.73%和70.87%，特異性分別為73.91%、72.46%、71.01%和91.30%，曲線下面積（area under curve, AUC）分別為0.764、0.742、0.759和0.908。見表5 和圖1。

圖1 外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相對表達量預測AMI發生的ROC曲線

表5 外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相對表達量預測AMI發生的效能分析參數

3 討論

AMI 是臨床常見心血管疾病之一，患者發病急，病死率高[13]。臨床早期預測AMI、盡早采取防治措施，有助于降低AMI 死亡風險。近期有研究結果顯示，線粒體功能生物合成障礙與多種心血管疾病有關，細胞外多種信號通路可影響線粒體生物合成，其中NO-PGC1α 是重要的調節因子之一，NO 可促使線粒體的生物合成[8-9]。NOS 作為調控L-精氨酸/NO 信號通路的重要限速酶，影響細胞內氧化應激狀態、心肌細胞內游離Ca2+濃度等，在血管擴張、心肌收縮抑制等生理過程中發揮重要作用[14]。

本研究中多因素Logistic 回歸分析結果顯示，外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量是影響AMI 發生的獨立因素，提示外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量與AMI 發生有關。Arg2 主要存在于心肌線粒體中，通過L-精氨酸底物影響NOS1 活性，調控NO 生成量，影響心血管組織生物學作用。SAVELIEVA 等[15]研究結果顯示，升高的Arg2 可能通過NO 信號通路影響心肌肥厚、缺血再灌注損傷等心血管疾病病理過程。Arg2 mRNA 相對表達量升高，使底物L-精氨酸利用率增大，NO 生成量降低，造成機體心肌細胞線粒體生物合成障礙，增大AMI 發生風險。NOS1 屬于含鐵生物酶之一，是合成NO 的關鍵酶，NOS1 mRNA 相對表達量升高可促進L-精氨酸產生大量NO，適量NO 具有保護心血管健康的生理功能，過量NO 則損傷心血管系統。PGC1α 主要存在于心肌等耗氧量大、能量需求量高的組織器官中，是心肌細胞線粒體生物合成的重要輔助激活因子、調控因子，可通過調控核呼吸因子、線粒體轉錄因子A 介導線粒體生物合成，NO-PGC1α mRNA 相對表達量升高可能導致心肌細胞線粒體生物合成功能異常，影響AMI 發生。聶俊剛等[16]研究結果顯示，PGC1α可通過氧化應激參與心肌缺血再灌注損傷過程。Arg2 mRNA 相對表達量升高可抑制NO 生成，而NOS1 mRNA 相對表達量升高可促進NO 生成，是相互矛盾的結果，但是NO-PGC1α mRNA 相對表達量升高可從側面反映NO 含量增加。ROC 曲線結果顯示，NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 3 者聯合預測AMI發生的特異性、AUC 最大，提示3 者聯合預測AMI 發生效能良好，可作為預測AMI 發生的客觀生物標志物。此外，本研究還發現重度狹窄組外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相對表達量高于中、輕度狹窄組，中度狹窄組NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相對表達量高于輕度狹窄組，提示外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 不僅與AMI 發生有關，而且與AMI 患者病情也有關，這是筆者后期研究的重點。

綜上所述，外周血NO-PGC1α 線粒體生物合成通路的相關基因NO-PGClα、Arg2 、NOS1 mRNA 與AMI 發生有關，3 者聯合預測AMI 發生效能良好，且NO-PGClα、Arg2 、NOS1 mRNA 表達可能與AMI患者病情有關，更精準的作用機制有待后續進一步研究闡明。