水解驢胎盤提取物對UV誘導皮膚細胞損傷的保護作用

廖峰 樊雨梅 唐潔 劉苓 熊麗丹

摘要 [目的]探究水解驢胎盤提取物防護光損傷的效果與作用機制，旨在填補水解驢胎盤提取物在防護UV光損傷方面的研究空白，實現驢胎盤的高值化利用。[方法]采用CCK-8方法探究水解驢胎盤提取物對HS68和HaCaT細胞增殖率的影響，利用UVA和UVB分別誘導HS68和HaCaT細胞建立體外光損傷模型，研究水解驢胎盤提取物對UV損傷HS68和HaCaT細胞的保護作用。[結果]0.10%～10.00%（V/V）的水解驢胎盤提取物可顯著促進HS68和HaCaT細胞生長;1.00%和0.50%（V/V）水解驢胎盤提取物可顯著減弱UVB對HaCaT細胞的損傷，顯著減少細胞內ROS的產生和MDA的分泌，顯著增加細胞內SOD活性;1.00%（V/V）水解驢胎盤提取物可顯著降低UVA輻射HS68細胞造成的MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA表達上升，但不能改善COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA表達的減少。[結論]水解驢胎盤提取物能夠防護UVA和UVB造成的皮膚光損傷，可能與提高抗氧化酶活性、降低脂質過氧化程度、抑制金屬蛋白酶的異常分泌有關。

關鍵詞 水解驢胎盤提取物;UVA;UVB;皮膚細胞;抗光損傷;保護作用

中圖分類號 S 879.9? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）12-0153-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.039

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Protective Effects of Hydrolyzed Donkey Placenta Extract on UV-induced Skin Cells Damage

LIAO Feng1，FAN Yu-mei1，TANG Jie2，3 et al

（1.National Engineering Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine，Dong-E-E-Jiao Co.，Ltd.，Liaocheng，Shandong 252201;2.Cosmetics Safety and Efficacy Evaluation Center，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610041;3.Sichuan Engineering Technology Research Center of Cosmetic，Chengdu，Sichuan 610041）

Abstract [Objective]To explore the effect and mechanism of the hydrolyzed donkey placenta extract in protecting against light damage，aiming to fill the gap in the research of hydrolyzed donkey placental extract in protecting against UV light damage，and realize the high-value utilization of donkey placenta.[Method]The effects of hydrolyzed donkey placenta extract on the proliferation of HS68 and HaCaT cells were studied by CCK-8 method.The photodamage models of HS68 and HaCaT cells induced by UVA and UVB were established.The protective effects of hydrolyzed donkey placenta extract on HS68 and HaCaT cells damaged by UV were studied.[Result]0.10% -10.00%（V/V） of hydrolyzed donkey placenta extract could significantly promote the growth of HS68 and HaCaT cells; 1.00% and 0.50% （V/V） of hydrolyzed donkey placenta extract could significantly attenuate UVB damage to HaCaT cells，significantly reduce intracellular ROS production and MDA secretion，and significantly increase intracellular SOD enzyme activity.1.00% （V/V） of hydrolyzed donkey placenta extract could significantly reduce the increase of MMP-1，MMP-3 and MMP-9 mRNA expression induced by UVA radiation in HS68 cells，but could not improve the decrease of COL Ⅰ and COL Ⅲ mRNA expression.[Conclusion]The hydrolyzed donkey placenta extract can protect the skin from photodamage caused by UVA and UVB，which may be related to increasing the activity of antioxidant enzymes，reducing the degree of lipid peroxidation，and inhibiting the abnormal secretion of metalloproteinases.06B1975A-ED6D-4890-8ABF-B47D9EA968F3

Key words Hydrolyzed donkey placenta extract;UVA;UVB;Skin cells;Anti-photodamage;Protective effect

胎盤作為妊娠期母體的臨時性器官，富含免疫球蛋白、膠原蛋白、激素、生長因子、細胞因子、氨基酸、糖胺聚糖、酶和微量元素等活性成分[1-2]，這些活性成分與胎盤提取物的生物活性有著密切的關系[3-4]。現代藥理研究表明，胎盤提取物具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗皺[7]、抗過敏[8]、改善黑色素代謝異常[9]、改善皮膚干燥和促進膠原合成[10]等作用，已被用于多種皮膚病的治療且效果明顯，包括接觸性皮炎[8]、脫發[11]、痤瘡瘢痕[12]和傷口愈合[3]等。鑒于胎盤提取物的良好效果，胎盤提取物廣泛應用于臨床和美容領域。許多國家開發了胎盤提取物相關護膚產品，如護膚霜、乳液等[3]。已有研究證實，口服豬胎盤提取物能夠有效改善皮膚干燥、皮膚屏障功能、彈性和皺紋[13-14]。進一步證實，口服豬胎盤提取物[14]和使用豬胎盤提取物凝膠[15]可有效改善中波紫外線（UVB）造成的氧化損傷、經皮失水量的增加與皺紋形成。有研究證實，豬胎盤提取物能夠明顯提高UVB光損傷角質形成細胞的活性、降低細胞活性氧自由基（ROS）水平、增加超氧化物歧化酶（SOD）的表達[15-16]。然而，長波紫外線（UVA）穿透能力較強，能直達皮膚真皮層，也是導致光老化的主要原因，目前對于胎盤提取物防護UVA的研究較少。因此，胎盤提取物作為護膚產品的抗光損傷效果和作用機制尚未被全面研究。

化妝品中禁止使用人胎盤和牛胎盤，所以豬胎盤、羊胎盤的使用較為廣泛。水解驢胎盤提取物作為一種具有開發前景的護膚品原料，相關應用報道較少。而且，目前有關驢的疫病國內外鮮見相關文獻報道[17]，可見相比于豬羊，驢胎盤相對安全。因此，筆者利用UVA和UVB分別誘導HS68細胞和HaCaT細胞損傷建立體外光損傷模型，探討水解驢胎盤提取物（hydrolyzed donkey placenta extract，HDPE）對UV損傷皮膚細胞的保護作用，旨在為水解驢胎盤提取物改善UV造成的光損傷提供了一定的研究基礎，填補水解驢胎盤提取物在防護UV光損傷方面的研究空白，實現驢胎盤的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑。DMEM培養基、胎牛血清（FBS），美國Gibco公司;八肽膽囊收縮素（CCK-8），日本同仁化學研究所;總SOD活性檢測試劑盒，南京建成生物研究所;脂質氧化MDA檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司;Trizol RNA提取試劑，賽默飛世爾科技;反轉錄試劑盒（HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR，+gDNA wiper）、實時熒光定量PCR試劑盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix），南京諾唯贊生物科技有限公司;引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.1.2 試材。永生化人角質形成細胞（HaCaT），中國科學院昆明細胞庫;人成纖維細胞（HS68），美國ATCC細胞庫;驢胎盤由東阿阿膠股份有限公司提供。

1.1.3 儀器。酶標儀、CFX-connect熒光定量PCR儀，美國Bio-Bad公司;倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司;ND-2000超微量核酸蛋白測定儀，美國Nano Drop公司;SS-04A型UVA儀、SS-04B型UVB儀，上海適瑪公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 HDPE的制備。取新鮮驢胎盤樣品，先用生理鹽水沖洗干凈，并用手術器械去除筋膜和臍帶。然后用自來水清洗數次，直至去除淤血。脫水絞碎后，1∶1加入蒸餾水，再加入MgCl2，加熱到70 ℃后保持30 min。經木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解，滅酶后過濾，上清液經0.22 μm濾膜過濾后，即為水解驢胎盤提取物。

1.2.2 HDPE對細胞存活率的影響。HaCaT細胞、HS68細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。將培養皿中生長至80%左右的HaCaT細胞、HS68細胞回收至離心管中，通過細胞計數儀計數，按照2.0×104～8.0×104 cells/孔接種至24孔細胞培養板中，培養24 h。試驗分為HDPE處理組（25.00%、10.00%、1.00%、0.10%、0.01%，V/V）和空白對照組。在37 ℃培養箱中繼續培養24 h。培養板內加入適量CCK-8 后培養4 h，測定450 nm吸光度，計算細胞在HDPE各體積分數作用下的存活率。

1.2.3 細胞分組處理。培養皿中生長至80%左右的HaCaT細胞，按照3.0×105～4.0×105 cells/孔接種至6孔細胞培養板中，培養24 h。試驗分為空白對照組、模型對照組和HDPE處理組（1.00%、0.50%和0.10%，V/V）。根據試驗分組設定，分別將配制好的待測物添加至HaCaT細胞內，在37 ℃培養箱中培養過夜24 h。倒掉培養液，每孔添加2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），放置于UVB輻照儀下，輻照能量30 mJ/cm2。空白對照組不照射UVB。棄去PBS，換成不含血清的培養基，培養6 h后，Trizol處理細胞并收集細胞用于mRNA表達檢測。

將融合至約80%的HS68細胞按照3.0×105～4.0×105 cells/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h。棄培養基，加入PBS，經5 J/cm2 UVA輻射后，分為UVA對照組（加DMEM培養基）和HDPE處理組（1.00%、0.50%、0.10%，V/V）。培養6 h后，Trizol處理細胞并收集細胞用于mRNA表達檢測。06B1975A-ED6D-4890-8ABF-B47D9EA968F3

1.2.4 UV輻照后水解驢胎盤提取物對細胞存活率的影響。同“1.2.2”的方法測定UV 輻照后水解驢胎盤提取物對細胞存活率的影響。

1.2.5 細胞氧化水平的測定。細胞內超氧化物歧化酶（SOD）、脂質氧化產物丙二醛（MDA）的測定按照試劑盒的說明進行檢測。

1.2.6 細胞內膠原蛋白mRNA表達的測定。

Trizol處理細胞后，提取總RNA，根據試劑盒反轉錄cDNA，以 cDNA 為模板擴增MMP-1、MMP-3、MMP-9、COL Ⅰ、COL Ⅲ，在預試驗探索出的反應條件下進行RT-PCR 反應。基因引物序列見表1。統計Ct值，計算相對表達情況進行結果分析。

1.3 統計分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，試驗重復3次，數據結果以均數±標準差（±S）表示。多組數據差異比較采用方差分析，兩組間差異比較采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 HDPE對UVB所誘導的HaCaT細胞損傷的保護作用

2.1.1 HDPE對HaCaT細胞存活率的影響。

采用CCK-8測定HDPE對HaCaT細胞存活率的影響，結果如圖1所示。水解驢胎盤提取物對HaCaT細胞存活率的影響受處理濃度調控，當給藥濃度在25.00%時，驢胎盤提取物對HaCaT細胞具有明顯的抑制效果（P<0.01）;給藥濃度在0.10%～10.0%，驢胎盤提取物可顯著促進HaCaT細胞生長（P<0.01）。由此可 見，10.00%及以下濃度為HDPE處理HaCaT細胞的安全濃度。

2.1.2 HDPE對HaCaT細胞增殖的影響。

HDPE以劑量依賴方式防護UVB輻射造成的HaCaT細胞損傷，見圖2。與空白對照組相比，UVB輻射模型組細胞存活率降低至86.11%，差異具有統計學意義（P<0.01），表明UVB輻射模型構建成功。與模型組相比，提前加入1.00%、0.50%和0.10%的HDPE分別使細胞存活率提升23.06%、11.59%和6.53%，其中1.00%和0.50%差異顯著（P<0.01）。可見，1.00%、0.50%的HDPE能夠顯著改善UVB造成的HaCaT細胞損傷。

2.1.3 HDPE對細胞SOD活性的影響。

過量的UV輻射皮膚后，促使機體產生大量ROS，當積聚在體內的ROS超過機體正常清除自由基的能力時，會對機體產生破壞性的生物學效應。SOD是生物體主要的抗氧化酶之一，能通過多種內源性細胞防御系統清除產生的氧自由基，防止脂質過氧化及其中間代謝產物對機體的損害。采用商品化試劑盒測定細胞內SOD活性，結果如圖3所示。與模型組相比，1.00%和0.50% HDPE處理過的細胞SOD活性分別增高9.83%和8.75%，但差異不具有統計學意義（P>0.05）。

2.1.4 HDPE對細胞MDA含量的影響。過量UVB照射皮膚，導致ROS大量積累，ROS不僅破壞細胞本身抗氧化酶，而且破壞細胞DNA、蛋白質，引起細胞脂質過氧化，導致氧化產物MDA含量增加，影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性。MDA作為細胞脂質過氧化的終產物，可反映膜脂質過氧化的程度。采用商品化試劑盒測定細胞MDA含量，結果如圖4所示，與空白對照組比較，模型組細胞MDA含量顯著增加（P<0.05），表明HaCaT細胞正常的抗氧化能力受到損傷，細胞膜的結構和功能遭到一定程度破壞。與模型組相比，1.00%、0.50%和0.10%的HDPE對細胞MDA含量增加有抑制作用，抑制率分別為105.00%、85.00%和16.87%，1.00%和0.50%組差異具有統計學意義（P<0.01），表明HDPE能一定程度抑制HaCaT細胞MDA含量，修復UVB輻射造成的細胞膜氧化損傷。

2.2 HDPE對UVA所誘導的HS68細胞損傷的保護作用

2.2.1 HDPE對HS68細胞存活率的影響。從圖5可以看出，HDPE濃度在10.00%～25.00%時，HDPE顯著抑制HS68細胞生長（P<0.01）;HDPE濃度在0.01%～1.00%時，HDPE顯著促進HS68細胞生長（P<0.01）。結果表明，1.00%及以下濃度是HDPE對HS68細胞的安全濃度。

2.2.2 HDPE對膠原mRNA表達的影響。膠原是皮膚真皮層的主要成分，由Ⅰ型膠原（type Ⅰ collage，COL Ⅰ;85%～90%）、Ⅲ型膠原（type Ⅲ collage，COL Ⅲ;10%～15%）和其他類型膠原構成，是皮膚強度和彈性的物質基礎。UV輻射可通過誘導 Ⅰ 型和 Ⅲ 型膠原的基因表達下調，引發成熟膠原的降解和影響膠原蛋白的合成[18-19]，導致皮膚彈性下降，產生松弛、皺紋等現象[20]。UVA照射導致HS68細胞COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA表達下降，但是HDPE在試驗研究劑量范圍內并不能改善此效果（圖6）。與模型組相比，加入HDPE后的HS68細胞的COL Ⅰ、COL Ⅲ的mRNA表達均顯著下降 （P<0.01）。說明試驗劑量范圍內，HDPE不能修復UVA輻射造成的HS68細胞COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA表達的下降。

2.2.3 HDPE對MMPs mRNA表達的影響。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在關節炎、皮膚老化、腫瘤侵襲和轉移等疾病病理過程中的組織破壞中起重要作用[21]。UV通過激活細胞信號轉導通路誘導表皮和真皮細胞MMP-1、MMP-3和MMP-9的表達，降解真皮細胞外基質的膠原蛋白和其他蛋白[22]。經UV輻射后，皮膚角質形成細胞與成纖維細胞合成分泌的MMP-1和MMP-3量及其mRNA水平顯著增加[23]。利用RT-PCR技術分析HDPE對UVA輻射HS68細胞MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA表達的影響，結果發現（圖7），HDPE以劑量依賴方式影響MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達。與模型組相比，1.00%、0.50%和0.10%的HDPE均顯著降低MMP-1的表達（P<0.01），1.00%的HDPE均顯著降低MMP-3和MMP-9 mRNA的表達（P<0.01），但是0.50%和0.10%的HDPE顯著增加MMP-3和MMP-9 mRNA的表達（P<0.01）。試驗結果表明，使用1.00%的HDPE可顯著緩解UVA輻射HS68細胞所致MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA表達的增加，從而減少UVA對膠原蛋白的降解。06B1975A-ED6D-4890-8ABF-B47D9EA968F3

3 討論

紫外輻射、空氣污染、不良生活習慣等均能導致皮膚老化，而紫外輻射是造成皮膚光老化的最主要因素。紫外線包含UVA、UVB、UVC，其中UVC在通過臭氧層時大部分被吸收，到達地球表面的紫外線主要包含UVA和UVB。紫外輻射對皮膚產生的影響包括色素沉著、皮膚老化、皮膚癌癥易感性增加以及毛細血管擴張等。UVA誘導產生ROS，過量ROS引起機體多種生物學效應，如脂質過氧化、激活轉錄因子和產生DNA鏈斷裂等[24]，導致MMPs累積、彈性蛋白變性、膠原蛋白降解，造成皮膚光老化。UVB可通過直接損傷DNA或誘導產生自由基等機制損害皮膚[24]，是產生良性或惡性腫瘤的主要因素[25]。因此，尋找有效的抗光老化方法已成為研究熱點。多項研究表明，口服胎盤提取物具有顯著的抗氧化活性，能夠有效改善UVB造成皮膚損傷和老化，但胎盤提取物是否對UVA造成的光老化有保護作用鮮見報道。

該試驗研究發現，1.00%、0.50%的水解驢胎盤提取物能夠明顯提高UVB光損傷HaCaT細胞活性，與Park等[15]的報道一致。1.00%、0.50%的水解驢胎盤提取物能夠提高SOD活性，降低MDA含量。Yamasaki等[16]研究證實，豬胎盤提取物能夠增加UV輻射的黑色素瘤細胞SOD-1、SOD-3和過氧化酶的表達，但是對SOD-2的表達沒有影響。然而，Yoshimoto等[26]研究發現豬胎盤提取物調節正常黑色素細胞的黑色素合成可能與SOD-2酶參與的線粒體呼吸有關;去除滲出物和不溶性物質（包括脂質）的豬胎盤提取物反而能夠促進黑色素的合成和抑制SOD-2酶表達。因此，推測胎盤提取物所含功效成分不同，可能是導致研究結果有差異的原因之一。Park等[27]利用動物試驗證實，甘氨酰-L-亮氨酸、L-亮氨酰-甘氨酸是胎盤提取物保護皮膚免受UVB損傷的主要功效物質。因此，需進一步明確水解驢胎盤提取物防護光老化的主要功效成分與具體作用通路。

1.00%的水解驢胎盤提取物可顯著緩解UVA輻射所致MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA表達的增加。Hong等[14]也報道豬胎盤物能夠顯著降低MMP-2、MMP-9的表達量。多項研究結果表明，胎盤提取物能夠有效改善皮膚彈性與皺紋[7，13-14]。Ⅰ 型膠原和Ⅲ型膠原是皮膚強度和彈性的主要物質基礎，推測胎盤提取物能夠有效提升 Ⅰ 型膠原和Ⅲ型膠原的表達。該試驗研究發現，0.10%～1.00%的水解驢胎盤蛋白并不能改善UVA造成 Ⅰ 型膠原和Ⅲ型膠原表達的下降。因此，需進一步全面研究水解驢胎盤提取物對UVA的防護作用，考慮是不是與水解驢胎盤提取物種的成分有關。

綜上所述，該試驗研究證實水解驢胎盤提取物對UVA和UVB導致的細胞光損傷均有保護作用，推測其機制與提高抗氧化酶活性、降低脂質過氧化程度、抑制金屬蛋白酶的異常分泌有關。該試驗對水解驢胎盤提取物抗皮膚光老化作用及其機制進行了研究，填補水解驢胎盤提取物在防護UV光損傷方面的研究空白，旨在實現驢胎盤的高值化利用，增加農民收入，提升農民養驢積極性。

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