Cathepsin D在不同宮頸病變中的表達意義及其與高危型HPV感染的相關性

歐陽晨捷 周東華 劉小燕 陳瑩 平靜 葛娟 潘育

目前宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的第二大疾病，其中以宮頸鱗狀細胞癌為最常見的組織學類型。我國每年新增宮頸癌人數約9.89 萬，占世界宮頸癌總人數的17.4%，每年死亡的人數達到3.05萬，有發病率不斷上升及發病年齡日趨年輕化的跡象[1]。因此，提高宮頸癌的診治水平十分緊迫。人乳頭瘤病毒（HPV）已被證實是宮頸癌的首要致病因素[2]，從感染到進展為癌需要8～10年。對宮頸上皮內病變（CIN）的患者早診斷、早治療以及系統隨訪是降低宮頸癌發病的關鍵。但不是所有感染高危型HPV的女性都會發生CIN或宮頸癌，說明在宮頸癌發生發展中，還有除了病毒以外的因素發揮致病作用。近年來，研究發現Cathepsin D參與了多種腫瘤的發生與發展[3，4]，是一類腫瘤侵襲、轉移相關的酶。但是，Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達情況鮮有報道。本研究旨在探討Cathepsin D在不同宮頸病變中的表達情況，分析其與高危型HPV感染的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集我院病理科2018年1月～2020年8月期間確診的40例子宮頸鱗狀細胞癌手術切除的患者組織標本（宮頸癌組）和58例CIN經陰道鏡活檢、宮頸錐切及子宮全切術標本（CIN組）；同時選取同期因子宮肌瘤和（或）子宮腺肌癥行子宮全切術的住院患者，術前常規行宮頸液基細胞學檢查，未見異常，并通過病理證實為慢性宮頸炎（等同于本實驗的正常宮頸組織）標本28例（對照組）。其中CINⅠ21例，CINⅡ18例，CINⅢ19例。患者年齡28～65歲，中位年齡45歲。所有患者在取材前都未做過任何特殊治療，也無特殊疾病史。

鼠抗人單克隆抗體Cathepsin D（D-7）:sc-377299購自美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC。免疫組織化學Power Vision二步法試劑盒（PV-9 000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，二抗DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Cobas 4800 HPV DNA檢測系統購自羅氏診斷公司。

1.2 免疫組織化學染色方法 組織切片經常規脫蠟、脫水后，用0.01mol/L的枸櫞酸緩沖液高壓修復10min,冷卻到室溫后，PBS沖洗3次，每次3min；3% H2O2室溫孵育10min，PBS沖 洗3次，每 次5min；滴加稀釋濃度為1：50的Cathepsin D一抗后，按Power Vision二步法免疫組織化學試劑盒（PV-9000）的說明書進行操作，二抗孵育30min后，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，返藍，脫水，透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。以Cathepsin D抗體試劑盒說明的涎腺組織作為陽性對照標本，同時采用PBS液取代一抗作為陰性對照標本。

1.3 高危型 HPV 檢測 基于實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）技術的Cobas 4800 HPV DNA檢測系統可檢測14種HPV高危亞型，即HPV16型、18型和其他12種高危HPV亞型匯總的結果。

1.4 結果判定 Cathepsin D陽性表達主要為細胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒，但要考慮到著色的強度及陽性細胞所占比例。本實驗建立了一個分值累加的系統：①按著色強度打分：無著色0分，淡黃色顆粒1分，棕黃色顆粒2分，棕褐色顆粒3分；②在目鏡視場數為22的200倍顯微鏡下，隨機看5個視野，取平均值，按陽性細胞所占比例打分：＜1%計為0分，1%～10%計為1分，10%＜陽性細胞數≤50%計為2分，50%＜陽性細胞數≤80%計為3分，＞80%計為4分。將①、②兩項分值相加為免疫組化最終評分，陰性：0～1分，陽性：2～7分。全部實驗對象的免疫組織化學染色切片由兩位病理醫師一致性雙盲觀察診斷。

1.5 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。組間率的比較采用χ2檢驗。兩組變量間的相關分析采用Spearman等級相關分析。檢驗采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cathepsin D在對照組、CIN 組和宮頸癌組中的表達 Cathepsin D在各組宮頸組織中的表達水平不同，在對照組、CIN 組、宮頸癌組中的陽性表達率分別為14.3%（4/28）、79.3%（46/58）、95.0%（38/40），各組間差異有統計學意義（χ2=55.518，P＜0.01）。宮頸病變逐漸加重，隨著Cathepsin D的陽性表達率逐漸升高，與宮頸病變程度呈正相關（r=0.608，P＜0.01）。見圖1～5。

圖1 Cathepsin D在正常子宮頸組織中的表達

圖2 Cathepsin D在CINⅠ中的表達

圖3 Cathepsin D在CINⅡ中的表達

圖4 Cathepsin D在CINⅢ中的表達

圖5 Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達

2.2 Cathepsin D在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組 內的表達在CIN組內，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中Cathepsin D的陽性表達率分別為61.9%（13/21）、83.3%（15/18）、94.7%（18/19），差異有統計學意義（χ2=6.810，P＜0.05）。

2.3 Cathepsin D在正常對照組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及宮頸癌組各組之間的比較 CIN組Cathepsin D陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義（χ2= 32.807，P＜0.01），宮頸癌組Cathepsin D陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義（χ2= 45.437，P＜0.05），宮頸癌組Cathepsin D陽性表達率高于CIN組，差異有統計學意義（χ2= 4.759，P＜0.05）。CINⅠ組和CINⅡ組（χ2= 2.198，P＞0.05）、CINⅡ組和CINⅢ組（χ2= 1.247，P＞0.05）以及CINⅢ組和宮頸癌組（χ2= 0.002，P＞0.05）之間差異無統計學意義，而在CINⅠ組和CINⅢ組之間差異有統計學意義（χ2= 6.166，P＜0.05）。

2.4 Cathepsin D和高危型HPV在宮頸病變組織中的相關性分析 通過Spearman等級相關分析提示，在不同程度宮頸病變中，Cathepsin D的表達與高危型HPV的感染呈正相關（P＜0.05）。見表1。

表1 Cathepsin D和高危型HPV的相關性分析（n）

3 討論

宮頸鱗癌的發病是一個從組織非典型增生到原位癌再到浸潤癌循序漸進的過程。發現高危型HPV病毒與宮頸癌發生有直接關系。在細胞惡性轉化過程中，E6、E7基因過度表達讓病毒基因整合，使宿主細胞的腫瘤抑制蛋白P53、Rb失活[5]。無疑持續的高危型HPV感染是導致CIN及宮頸癌的首要因素。但感染高危型HPV并不完全造成必然發生宮頸癌，還需要其他方法的適當介入來提高宮頸癌篩查的準確率。近年來，研究者們發現Cathepsins（組織蛋白酶）作為人體中重要的信號分子，有序地調節著人體的生命過程；一旦失調，會導致腫瘤的發生。根據氨基酸活化部位的不同，Cathepsins家族有11個成員，分布于各種哺乳動物組織的細胞溶酶體內，是一組強效的溶酶體水解酶，與腫瘤侵襲、轉移相關[6]。Cathepsin D是Cathepsins家族中的一員，是一種天冬氨酸溶酶體蛋白水解酶。在腫瘤的酸性微環境中，Cathepsin D的高表達可作為一種絲裂原會引起有絲分裂時，有絲分裂原底物的調控失常，引起細胞分化的缺乏，并且刺激細胞不斷迅速分裂、生長，引起克隆性無限增殖[7]。本研究發現Cathepsin D在CIN和宮頸癌組織中的陽性表達率均高于正常宮頸組織（P＜0.05），在宮頸癌組織的陽性表達率高于CIN組織（P＜0.05），在CINⅢ組織的陽性表達率高于CINⅠ組織（P＜0.05），Cathepsin D的陽性表達率與宮頸病變程度呈正相關（r=0.608，P＜0.05），符合宮頸鱗癌的進展過程，可提示Cathepsin D的表達上調促進了宮頸鱗癌的發生與發展。Cathepsin D一方面通過水解作用使細胞外基質降解，讓腫瘤細胞順利快速轉移；另一方面通過使Cathepsin B、尿激酶原激活因子激活，并與尿激酶原激活因子受體結合，參與與腫瘤相關的分解作用[8]。Cathepsin D的過度表達還可激活溶酶體靶通道，讓Cathepsin D蛋白酶原及其它溶酶體酶不斷分泌和釋放[9]，促進了周圍局部溶解區域的形成，為腫瘤細胞的侵襲轉移提供了通道，進而激發了腫瘤細胞侵襲轉移的潛能。通過Spearman等級相關分析，在不同程度宮頸病變中，Cathepsin D的表達與高危型HPV的感染呈正相關（r=0.242，P=0.006），提示Cathepsin D表達上調和高危型HPV感染在宮頸癌的發病機制中可能起著協同作用。

綜上所述，Cathepsin D在子宮頸鱗狀細胞癌發生發展過程中表達逐漸升高，說明Cathepsin D在宮頸癌的發病機制中起到了一定的促進作用，可能參與宮頸鱗癌的侵襲轉移過程。Cathepsin D的高表達和高危型HPV的感染在宮頸病變的發生發展過程中有著密切的聯系，兩者在宮頸癌的發病機制中可能起著協同作用，為宮頸癌發病機制和治療的研究提供了新思路，但這一推測需要后續的實驗研究進一步驗證。