阿加曲班聯合聲動力療法抗C6膠質瘤細胞作用的相關研究

詹奇，楊欣

1.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經外三科，黑龍江哈爾濱 150000；2.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院干部一病房，黑龍江哈爾濱 150000

顱內最常見的腫瘤之一為腦膠質瘤，目前研究未發現其徹底根治的療法，故此治療膠質瘤、提升生存率已成為神經外科領域中的診療難點。目前外科手術只能盡力全部切除，輔助放療和化療等方法的療效仍不理想，患者往往在術后一段時間復發，難以根治。聲動力療法（SDT）原理為超聲能夠激活光敏劑中的某些卟啉類增敏劑效應，從而殺傷腫瘤細胞，其組織穿透性更深[1-2]。SDT療法在體外和體內同時具有抑制膠質瘤生長的作用。凝血酶受體（PAR）-1可促進內皮細胞和腫瘤細胞生長增殖，使腫瘤細胞的致瘤性增強；同時，PAR-1能增加體外腫瘤細胞和腫瘤微環境中各種成分的粘附性，使細胞在體內的轉移過程加快，從而誘導血管生長因子的合成及分泌，被認為是一種潛在的促血管生長因子，與腫瘤的發生、發展有著密切的關系[3-4]。阿加曲班是一種新型凝血酶抑制劑藥物，它能夠可逆地、高選擇性地和凝血酶活性相應位點結合，以此來阻斷由凝血酶催化的一系列復雜凝血過程，抑制血凝塊中的凝血酶活性[5-6]。該研究于2020年7月—2021年7月探討應用阿加曲班聯合聲動力治療C6膠質瘤細胞的效果，結果可見二者聯合治療可提高抑瘤率，為臨床阿加曲班聯合聲動力療法治療腦膠質瘤奠定堅實的基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

細胞系：C6 膠質瘤細胞系。主要試劑：DMEM，10% 新生小牛血清，0.25% 胰酶，血卟啉甲醚（HMME），阿加曲班，兔抗鼠PAR-1抗體。

1.2 方法

1.2.1 C6膠質瘤細胞培養選取10%胎牛血清的完全培養液，將C6 膠質瘤細胞接種于培養瓶中，放入37℃、5%CO2的常規細胞培養箱中，常規2～3 d換液，待細胞處于對數生長期時收集細胞，將其進行實驗分組。隨機分為4組，A組：空白對照組，不給予藥物治療。B 組：聲動力（SDT）組。C 組：阿加曲班組。D組：聲動力+阿加曲班組。

1.2.2 Real-time PCR 檢測 用三唑溶液（Invitrogen）分離細胞RNA。然后，利用PrimeScriptTM RTMaster Mix 將RNA 反 向 轉 錄 成cDNA。RT-qPCR 是 與SYBR 預混料Ex-Taq-Ⅱ在480 儀器上實施。采用比較Ct法檢測基因表達。

1.2.3 Western blot 檢測Wnt 蛋白表達，培養每組5×106個細胞，裂解細胞，25 μg 蛋白樣品；依次經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳、轉膜、封閉等步驟；通過增強化學發光法(ECL)檢測蛋白表達，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析各蛋白條帶相對吸光度，并作定量計算。選用B-actin為內參對照組。

1.2.4 MTT 法檢測收集對數生長期C6 膠質瘤細胞，接種于96 孔板，每孔100 μl，每孔為8×103個細胞，每組設計5個復孔。加入氯化鈷、不同濃度VEGF抗體藥液處理24 h 后，每孔加入檢測溶液（5 mg/mL）20 μl，37℃孵育4 h，棄去孔內培養基，每孔再加入200 μl 二甲基亞砜，作用10 min。以空白孔調零，酶聯免疫檢測儀檢測490 nm波長處吸光度，重復3次，計算各組數據均值。以對照組細胞活性為100%，處理組吸光度值與對照組比值×100%即為實驗各組細胞活性。

1.2.5 FCM 法檢測C6 膠質瘤細胞貼壁生長，經胰酶消化、放入離心機離心，培養液懸浮，制成單細胞懸液5 mL，放入直徑1.0 cm 的10 mL 玻璃試管中，分組SDT 處理。4 組細胞繼續避光培養6 h，離心棄上清收集細胞，PBS 溶液洗滌2 次，75%酒精固定，制備5×106的單細胞懸浮液1 mL，4℃放置24 h，用流式細胞儀檢測4組腫瘤細胞的凋亡率情況。

1.3 統計方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料用（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Real-time PCR 檢測結果

聲動力療法治療后通過Real-time PCR 檢測PAR-1 表達情況，結果顯示聲動力療法治療后，C6膠質瘤細胞中PAR-1 表達較治療前顯著升高，見圖1。聲動力組治療后PAR-1 表達水平為（7.844±0.288），與對照組（4.844±0.184）比較，差異有統計學意義(t=3.416，P＜0.05)。

圖1 聲動力治療前后Real-time PCR 檢測C6膠質瘤細胞中PAR-1的mRNA表達情況

2.2 Western blot檢測結果

聲動力療法治療后通過Western blot 檢測PAR-1表達情況，結果顯示聲動力療法治療后，C6膠質瘤細胞中PAR-1 表達較治療前顯著升高，見圖2。聲動力組治療后PAR-1 表達為（9.874±0.273），與對照組（4.746±0.167）比較，差異有統計學意義(t=3.511，P＜0.05)。

圖2 聲動力治療前后Western blot檢測C6膠質瘤細胞中PAR-1的蛋白表達情況

2.3 MTT法檢測結果

SDT+阿加曲班組與其他3 組比較，抑瘤率顯著升高；阿加曲班組、SDT 組抑瘤率較對照組高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.4 FCM檢查結果

SDT+阿加曲班組與其他3 組比較，凋亡率顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；阿加曲班組、SDT組凋亡率較對照組高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 4組MTT法檢測FCM檢查抑瘤率、凋亡率比較[(±s),%]

表1 4組MTT法檢測FCM檢查抑瘤率、凋亡率比較[(±s),%]

組別SDT+阿加曲班組阿加曲班組SDT組對照組抑瘤率62.36±11.34 15.76±10.12 14.36±9.24 0.01±7.12凋亡率39.36±4.56 12.36±5.23 11.56±4.12 1.36±0.12

3 討論

聲動力療法（SDT）是目前研究發現的一種新的腫瘤治療方法，它來源于光動力療法，是1989年由Umemura等在研究超聲診斷和血卟啉的協同效應而發展成的。大量實驗證明SDT在體內及體外具有抑制膠質瘤生長的作用，由于SDT 相比PDT 有更深的組織穿透性，超聲亦能激活原為光敏劑的某些卟啉類增敏劑而殺傷腫瘤細胞[7-9]。超聲能夠穿透深部組織而激活增敏劑；光、聲動力聯合治療其原理為激活共同的增敏劑，產生更多的毒性物質，從而增強殺傷腫瘤細胞的效果。

Billroth 于1878年在實驗研究證實的基礎上提出觀點為在腫瘤轉移和凝血機制之間存在某種聯系的假說理念，使廣大學者對凝血系統和腫瘤的關系進行了深入廣泛的研究[10]。相關研究證實了凝血酶存在于多種類型的腫瘤細胞中，從而解釋了在腫瘤患者中出現的高凝現象，但并不能完全解釋凝血酶與腫瘤發生、發展存在直接、密切的關聯[11-13]。有研究證實，凝血酶能促進腫瘤的生長轉移功能，因為凝血酶本身具有促進腫瘤血管生長的能力，其促血管生成作用在雞胚尿囊膜實驗中已被證實，同時發現此研究效應是通過特殊凝血酶受體PAR-1 介導協同完成的，與纖維素的形成無關聯[14]。凝血酶在腫瘤的血管形成發展中起到了重要的作用，是腫瘤生長轉移的必要條件。凝血酶可促進腫瘤細胞和內皮細胞的生長增殖，腫瘤細胞的致瘤性增強，能增加腫瘤微環境中各種成分的粘附聚集，細胞在體內的轉移過程不斷加快，從而誘導血管生長因子的分泌合成，其被認為是一種潛在的促血管生長因子，與腫瘤的發生、發展有密切的關系。

阿加曲班是一種新型的凝血酶抑制劑藥物，它能夠可逆地、高選擇地與凝血酶活性相關位點相結合，中斷凝血酶催化的一系列凝血過程。臨床應用于腦血栓、腦梗塞、靜脈竇血栓治療中，并取得良好效果。以往的研究中，阿加曲班可抑制PAR-1 表達水平，MTT 法檢測阿加曲班組的抑瘤率為（14.25±9.36）%，與其他組對比，差異有統計學意義(P＜0.05)，與該研究結果相吻合；該研究中，MTT 法檢測SDT+阿加曲班組的抑瘤率為（62.36±11.34）%，與其他三組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；阿加曲班組的抑瘤率（15.76±10.12）%較對照組抑瘤率高，但較SDT+阿加曲班組抑瘤率低(P＜0.05)；SDT 組（14.36±9.24）%較對照組（0.01±7.12）%高，但較SDT+阿加曲班組低(P＜0.05)。有學者用膠原酶Ⅳ誘導大鼠腦出血模型，研究結果可見，應用阿加曲班72 h能顯著減輕腦水腫，血腫未見擴大；應用阿加曲班24 h能抑制多形核白細胞的滲出，抑制單核-巨噬細胞的活性。故此，阿加曲班能減輕腦出血后伴發腦水腫在內的繼發性腦損傷病例[15-16]。Huang J 等[15]研究指出，凝血酶通過誘導腦水腫發展形成、增殖細胞和生成血管的作用，引發膠質瘤患者不良的預后反應。而應用阿加曲班治療，通過抗凝血酶能夠減輕腦水腫發展程度，減慢膠質瘤的生長速度，從而改善腫瘤導致的神經性功能障礙情況[16-18]。該文中，Real-time PCR 檢測顯示，聲動力組治療后PAR-1 表達水平為（7.844±0.288），與對照組（4.844±0.184）比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；Western blot 檢測顯示，聲動力組治療后PAR-1 表達為（9.874±0.273），與對照組（4.746±0.167）比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。SDT+阿加曲班組與其他3組比較，凋亡率顯著升高；阿加曲班組、SDT組抑瘤率較對照組高(P＜0.05)。

綜上所述，應用阿加曲班聯合聲動力治療C6膠質瘤細胞，可以提高抑瘤率，為臨床應用阿加曲班聯合聲動力治療腦膠質瘤的研究奠定了實驗基礎。