探討miRNA 標(biāo)記物在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制

黃志剛，馬克，劉晶

深圳市第三人民醫(yī)院骨科，廣東深圳 518100

當(dāng)前，臨床治療中移植的成骨細(xì)胞主要源自自體成骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而得到的細(xì)胞[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是自我更新能力強(qiáng)且便于取材，應(yīng)用前景更為廣闊。目前，臨床對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論，并且誘導(dǎo)分化出來(lái)的細(xì)胞大都是成骨樣細(xì)胞[2]。miRNA 屬于具備一定調(diào)控作用的微小分子，其調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用已經(jīng)得到證實(shí)[3]。有研究指出，miRNA 可調(diào)節(jié)骨及成骨細(xì)胞分化，但得到miRNA 靶基因的確切數(shù)據(jù)很少，尚無(wú)法明確miRNA 在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化中發(fā)揮的具體調(diào)控機(jī)制[4]。該次研究選取2016年6月—2018年1月該院收治的40例脊柱結(jié)核患者為研究對(duì)象，通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞過(guò)程中miRNA 差異表達(dá)進(jìn)行觀察，并篩選出特異性miRNA，以明確其確切的調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院收治的40例脊柱結(jié)核患者進(jìn)行該次研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：生長(zhǎng)發(fā)育正常；年齡≥18歲；經(jīng)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查確診；均接受手術(shù)治療；脊柱結(jié)核活動(dòng)期同時(shí)具備嚴(yán)重骨質(zhì)破壞、較大寒性膿腫；行徹底病灶清除術(shù)；組織病理學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪樣物質(zhì)或朗罕斯細(xì)胞和/或結(jié)核桿菌組織標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性；無(wú)其他可疑疾病；患者知曉該次研究?jī)?nèi)容并簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：早期影像學(xué)表現(xiàn)不明顯者；合并其他（脊柱外）臟器結(jié)核病者；骨病治愈型、靜止型脊柱結(jié)核者；行器官移植、同種異體組織移植及人工假體植入者；合并HIV 等自身免疫性疾病者。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器TGF-β1、異硫氰酸熒光素、CD54-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC、兔抗大鼠神經(jīng)巢蛋單抗、兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶單抗、PCR 引物、倒置相差顯微鏡、BIGeneAmp9700PCR 儀、FC500MCL/MPL流式細(xì)胞儀。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)抽取受試者股骨骨髓，通過(guò)磷酸鹽緩沖液在肝素抗凝管中進(jìn)行稀釋，將人淋巴細(xì)胞分離液加入提取液中，離心（1 400 g）10 min 后取中間層，應(yīng)用PBS 進(jìn)行兩次沖洗，繼而接種到培養(yǎng)瓶中。在37℃、4%CO2、94%培養(yǎng)濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)密度維持在1×109/L，培養(yǎng)3 d 后換液，之后每間隔2 d 換液1 次。換液后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行顯微觀察，細(xì)胞單層達(dá)到80%融合度后實(shí)施胰蛋白酶消化，并以1:2 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)代數(shù)分別記為P1、P2、P3、P4。

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定應(yīng)用PBS 對(duì)P4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞洗滌3次，細(xì)胞濃度維持在1×106個(gè)/L，將其制成1 mL 細(xì)胞懸液并放置在EP 管中，繼而分別加入5 μl 異硫氰酸熒光素、CD54-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC 單抗，同時(shí)設(shè)定同型陰性對(duì)照，在37℃條件下反應(yīng)半小時(shí)，離心（800 g）20 min，應(yīng)用PBS對(duì)細(xì)胞重懸，通過(guò)流式細(xì)胞儀實(shí)施檢測(cè)。

1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定以5×106個(gè)/L的濃度P4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1 mL，將基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入后按其組成把細(xì)胞分為對(duì)照組和陽(yáng)性組，兩組細(xì)胞進(jìn)行3 d 的培養(yǎng)后進(jìn)行培養(yǎng)液更換，之后每間隔2 d 進(jìn)行一次更換，培養(yǎng)3 周。結(jié)束誘導(dǎo)后去除培養(yǎng)液，應(yīng)用PBS 沖洗3 次，應(yīng)用4%多聚甲醛進(jìn)行20 min固定，繼而石蠟包埋并常規(guī)切片，甲苯胺藍(lán)染色。

1.2.5 基因芯片檢查收集成骨細(xì)胞誘導(dǎo)前（T0）及培養(yǎng)后1 周（T1）、2 周（T2）、3 周（T3）的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用一步法進(jìn)行總RNA 提取，熒光標(biāo)記擴(kuò)增完成后的RNA 樣品，實(shí)施激光掃描，通過(guò)SAM version 2.1 軟件對(duì)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后有差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析。

1.2.6 miRNA 驗(yàn)證 把成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3 周的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以實(shí)時(shí)定量miRNA 為引物、cDNA 為模板實(shí)施PCR 反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件如下：保持引物濃度在0.3 μmmol/L左右，96℃條件變性20 s，然后60℃條件退火45 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；一致性采用Kappa檢驗(yàn)，≤0.4Kappa值≥0.75 表示一致性極好，Kappa值＜0.75 表示一致性較高，Kappa值＜0.4 表示一致性較差，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化期間篩選出差異表達(dá)miRNA，其中，miR-130b、miR-193b 為表達(dá) 上 調(diào)miRNA，miR-135、miR-424 為 表 達(dá) 下 調(diào)miRNA。于原樣本中實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果同基因芯片篩選結(jié)果存在高度一致性（Kappa=0.913，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA表達(dá)(±s)

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA表達(dá)(±s)

注：△表示與T0相比，P＜0.05

miRNA miR-130b miR-193b miR-424 miR-135 T0 1.00±0.06 1.00±0.12 1.00±0.15 1.00±0.15 T1（1.71±0.15）△（1.07±0.14）△（0.95±0.05）△（0.66±0.04）△T2（1.83±0.21）△（1.48±0.16）△（0.87±0.03）△（0.62±0.04）△T3（2.75±0.23）△（1.93±0.22）△（0.68±0.02）△（0.55±0.04）△

3 討論

在全身骨及關(guān)節(jié)結(jié)核病中，脊柱結(jié)核的患病率位居首位，且最為常見(jiàn)的患病部位為胸腰椎段，脊柱結(jié)核在各年齡段人群中均有發(fā)病的可能，而高發(fā)人群是青壯年，由于脊柱結(jié)核病存在破壞性生長(zhǎng)情況，對(duì)患者身體正常發(fā)育的影響極為嚴(yán)重[5]。現(xiàn)階段，臨床治療脊柱結(jié)核的方案主要有充足睡眠、臥床休息、營(yíng)養(yǎng)支持等支持療法、抗結(jié)核藥物治療、手術(shù)治療以及康復(fù)治療[6-8]。因脊柱結(jié)核導(dǎo)致的椎體破壞單純應(yīng)用藥物治療是無(wú)法完全修復(fù)的，而患者行結(jié)核病灶清除術(shù)治療后會(huì)出現(xiàn)結(jié)核性骨缺損，需進(jìn)行植骨填補(bǔ)，否則會(huì)導(dǎo)致椎體塌陷，但人工骨移植又會(huì)產(chǎn)生諸多并發(fā)癥，對(duì)此組織工程學(xué)修復(fù)成為了治療脊柱結(jié)核的潛在方案之一[9-11]。miRNA 是一種參與轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控的微小RNA，廣泛存在于生物體中，miRNA 與靶基因miRNA 堿基進(jìn)行配對(duì)，進(jìn)而致使靶基因miRNA 堿基降解或翻譯受阻，最終發(fā)揮出真正的調(diào)控作用[12-14]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新及多向分化的潛在能力，有研究已經(jīng)證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等諸多細(xì)胞株，也是主要的成骨進(jìn)行自我修復(fù)的種子細(xì)胞來(lái)源[15]。

該次研究結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化期間篩選出差異表達(dá)miRNA9，其中，miR-130b、miR-193b 為表達(dá)上調(diào)miRNA，miR-135、miR-424 為表達(dá)下調(diào)miRNA。于原樣本中實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果同基因芯片篩選結(jié)果存在高度一致性（Kappa=0.913，P＜0.05）。這與劉軍政等[16]學(xué)者的結(jié)論一致，在其研究中得出，給予實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證同基因芯片篩選結(jié)果存在一致性（Kappa=0.876，P＜0.05）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞屬于一類具備自我更新能力和多向分化的干細(xì)胞，當(dāng)前多項(xiàng)研究也已經(jīng)證實(shí)了miRNA 會(huì)參與到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的調(diào)節(jié)中，但miRNA 具體的調(diào)節(jié)作用屬于一種非常復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，目前的研究還處在初級(jí)階段[9-10]。

綜上所述，高表達(dá)的miR-130b、miR-193b 及低表達(dá)的miR-135、miR-424 均能有可能調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程。但由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方式及來(lái)源有所差異，致使既往各研究結(jié)果所報(bào)道的miRNA 種類存在一定差異，因此，確切地參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的miRNA尚需深入研究證實(shí)。