LncRNA MALAT1 沉默對人腎透明癌細胞786-O 的生物學影響

宮再興，徐慶剛

（江西中醫藥大學附屬醫院泌尿外科，南昌 330006）

腎透明細胞癌 （Renal Cell Carcinoma, RCC），是泌尿系統常見惡性腫瘤之一， 來源于腎實質泌尿小管上皮系統， 發病率僅次于前列腺癌和膀胱癌[1]。 目前腎癌的病因尚不明確， 可能與遺傳、吸煙、肥胖、高血壓及抗高血壓治療等因素有關，促使研究者從各個層面研究探討， 尋求新的治療策略。 長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt 的不能編碼蛋白質的RNA 分子， 但是可以從多個層面調控蛋白質的編碼基因的表達水平[2]。近年來， 各國學者對lncRNA 的研究不斷深入，發現并證實多個lncRNA 的異常表達與惡性腫瘤息息相關[3]。 肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasisassociatedlungadenocarcinomatranscript1,MALAT1）是一個高度保守和豐度的lncRNA，位于人類染色體11q13.1 上，主序列包括了8000 多個核苷酸，廣泛分布于人體各組織器官中， 通過多種方式在表觀遺傳學水平上引起腫瘤細胞的惡性增殖， 侵襲能力上升，凋亡減弱，進而影響腫瘤患者的病情進展及后期藥物的治療效果等。 我們通過干涉非編碼RNA MALAT1 的表達，研究對人腎透明細胞癌細胞786-O 的影響， 為腎細胞癌的診療提供新的策略。

1 實驗材料與方法

1.1 材料 人腎透明細胞癌細胞786-O 細胞由中國科學院（上海）細胞類型培養研究所購得，shRNA由上海依祥生物技術有限公司合成，TRIZOL 試劑購自北京全式金生物技術有限公司，MALAT1 引物、Lipofectamine 2000 reagent 均 購 自 美 國Invitrogen 公 司，qPCR 試 劑 盒 購 自TaKaRa 公 司，RPMI 1640 培養基、牛血清白蛋白（Albumin Bovine V） 均購自美國Gibco 公司，ABI7900 型Realtime-PCR 儀購自美國ABI 公司，CCK-8 Cell Counting Kit 購自諾唯贊生物， 全自動板式酶標儀購自奧地利TECAN 公司，24 孔板用細胞培養池（透明PET膜8.0 μm） 購自美國Corning 公司，PRIMER IPAGE 11-59 BP、FACSCalibur 流式細胞儀購自BD 公司，Annexin V/PI apoptosis kit 購自聯科生物。

1.2 方法

1.2.1 轉染 實驗分三組：實驗組（shRNA-MALAT1組）、陰性對照組（shRNA-NC 組）、正常培養組。 用胰蛋白酶消化細胞后并計數，將細胞以1×105/孔接種在六孔板上， 加入2 mL 含FBS 的細胞培養基，放入恒溫培養箱中， 當培養的細胞數量≥80%時，按脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM 2000 說明書依次轉染，每組平行3 孔，用熒光顯微鏡觀察轉染效率，便于后續試驗。

1.2.2 qPCR 檢測各組MALAT1 基因的表達 轉染36 h 后提取RNA， 逆轉錄為cDNA，MALAT1 引物為5′-TGCAGCCCGAGACTTCTGT -3′，5′-GCTTC TGCGTTGCTAAAATGG-3′。 GAPDH 引 物 為5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，5′-GTGGTC GTTGAGGGCAATG-3′。 進行qPCR，95 ℃預變性30 s 后，進入40 個循環：95 ℃10 s； 60 ℃30 s。

1.2.3 CCK8 檢測各組細胞生長情況 轉染后的各組細胞培養至對數期， 用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，接種到96 孔板（每組設定5 個復孔），放置細胞培養箱中培養，分別于接種后0 h、24 h、48 h、72 h 加入10 μL CCK-8 溶液，繼續37 ℃孵育2 h，450 nm 波長下利用酶標儀測定各孔板各組細胞的吸光值。

1.2.4 Trsanwell 小室檢測各組細胞侵襲能力 用胰蛋白酶將各組細胞消化成單細胞懸液， 收集各組細胞，調整細胞密度至1～10×105個/mL，用移液槍吸取100 μL， 接種于預先鋪膠4℃過夜的Transwell 上室， 加入500 μL 含趨化因子的培養基，放入細胞培養箱中常規培養48h，用棉簽小心擦去上室內的細胞，4%多聚甲醛固定5 分鐘后用PBS 反復淋洗，再4 g/L 的結晶紫溶液染色。 在倒置顯微鏡下每個樣本隨機取5 個單獨視野并計數拍照。

1.2.5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況 用不含EDTA 的胰蛋白酶將各組細胞消化成單細胞懸浮液， 并用預冷的PBS 洗滌。 先后加入100 μL 1 Binding Buffer 重懸細胞、5 μL Annexin V- FITC、10 μL PI 輕輕混勻，避光、室溫反應5 min。 流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 數據統計分析 使用SPSS 26.0 對實驗結果進行統計學數據分析，計量資料以（±s）表示，任意兩組間的數據分析使用t 檢驗，三組間數據分析使用單因素方差分析，P＜0.05 提示組間數據差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染效率檢測 用熒光顯微鏡觀察轉染效率（圖1A，1B）， 轉染成功標準為細胞體內有綠色熒光出現，且熒光細胞占比大于80%，轉染48 h 后用于后續實驗。

圖1 B 陰性空轉組（shRNA-NC 組）轉染后

圖1 A 實驗組（shRNA-MALAT1 組）轉染后

2.2 各組MALAT1 基因的qPCR 檢測 采用實時熒光定量PCR 技術檢測實驗組、陰性對照組、正常培養組腎透明細胞癌786-O 細胞中MALAT1 的表達量情況， 結果顯示， 實驗組MALAT1 表達水平（0.326±0.049）明顯低于陰性對照組（1.006±0.194）和正常培養組（0.982±0.161），差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。提示沉默lncRNA MALAT1 效果顯著。

圖2 MALAT1 在各組腎透明細胞癌細胞786-O 中的相對表達量（*P＜0.05）

2.3 沉默lncRNA MALAT1 的表達對各組癌細胞增殖的影響 采用CCK8 法檢測實驗組、陰性對照組、 正常培養組腎透明細胞癌細胞786-O 的增殖情況分別為（1.710±0.081），（1.977±0.292），（2.003±0.277），并繪制細胞生長曲線，見圖3。 與正常培養組和陰性對照組相比， 實驗組癌細胞增殖細胞活性明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示沉默lncRNA MALAT1 的表達能夠明顯抑制腎透明細胞癌細胞786-O 的增殖。

圖3 CCK8 檢測各組腎透明細胞癌細胞786-O 增殖情況曲線圖（*P＜0.05）

2.4 沉默lncRNA MALAT1 表達對各組癌細胞侵襲能力的影響 采用Trsanswell 侵襲實驗檢測實驗組、 陰性對照組、 正常培養組腎透明細胞癌細胞786-O 的穿透Matrigel 膠轉移到Trsanswell 膜背面的細胞數，與正常培養組（110.40±7.925）和陰性對照組（106.40±4.722）相比，實驗組（54.40±7.403）侵襲細胞個數明顯降低（圖4），差異具有統計學意義（P＜0.05），而與正常培養組相比，陰性對照組侵襲細胞數量無明顯差異（P＞0.05，圖5）。 提示沉默lncRNA MALAT1 的表達能夠明顯降低腎透明細胞癌細胞786-O 的侵襲能力。

圖4 Trsanwell 侵襲實驗檢測各組腎透明細胞癌細胞數量（400 倍）

圖5 Trsanswell 侵襲實驗檢測各組腎透明細胞癌細胞數量柱狀圖（*P＜0.05）

2.5 沉默lncRNA MALAT1 表達對各組癌細胞凋亡的影響 采用流式細胞術檢測實驗組、陰性對照組、 正常培養組腎透明細胞癌細胞786-O 的平均凋亡率，與正常培養組（22.456±2.443）%和陰性對照組（21.586±2.285）%相比，實驗組的癌細胞凋亡率（80.158±6.181）%明顯增高，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖6），而陰性對照組細胞凋亡與正常培養組細胞凋亡無明顯差異（P＞0.05，圖7）。 提示干涉lncRNA MALAT1 的表達能夠明顯增加腎透明細胞癌細胞786-O 的凋亡。

圖6 各組流式細胞細胞檢測圖

圖7 流式細胞儀檢測各組腎透明細胞癌細胞凋亡柱狀圖（*P＜0.05）

3 討論

RCC 作為致死率最高的泌尿系統惡性腫瘤，每年全世界約有40.3 萬新發病例[4]，盡管早期腎癌可以通過手術治療達到臨床治愈， 但是仍有約35%患者表現為晚期或轉移性RCC。 伴隨高通量測序與生物信息分析技術的飛速發展， 促進我們從遺傳學的角度認識和探究RCC 的診治， 越來越多的研究證明，lncRNA 在RCC 的發生、 發展和預后中扮演重要的角色[5]。

Ji P[6]等在2003 年預測早期非小細胞肺癌的轉移時首次發現肺腺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1)，在其超保守的3' 端存在一個tRNA 樣三葉草的二級結構， 可以被核糖核酸酶P 和Z 識別與切割, 生成近3' 端的短RNA 和兩種RNAMALAT1， 剩余的3' 端與RNase Z 結合并剪切,生成一個長度為61nt 的成熟tRNA 樣轉錄本轉移至細胞質[7]。多項實驗研究證明MALAT1 通過調控選擇性剪接、 基因轉錄、 細胞周期以及充當miRNA的海綿等方式參與惡性腫瘤的發生、發展、轉移和預后。

我們通過構建shRNA 載體，沉默非編碼RNA MALAT1 在腎透明細胞癌細胞786-O 中的表達，結果發現，下調MALAT1 基因的表達后，腎透明細胞癌細胞786-O 的細胞增殖降低，侵襲能力下降，細胞凋亡增加，提示lncRNA MALAT1 的過表達可能是導致腎透明細胞癌的發生、 發展和轉移的重要原因，查閱相關文獻，推測MALAT1 可能通過改變mRNAs 前體的選擇性剪接[8]；或通過與起始復合體(PRC2)結合，阻止組蛋白甲基化轉移酶(EZH2)與HIV-1 長末端重復(LTR)啟動子結合，使PRC2所介導的組蛋白無法甲基化[9]；或通過誘導三甲基化的組蛋白3 賴氨酸(H3K9)合成增多[10]，從而達到抑制靶基因的表達，誘發惡性腫瘤的生成。 提示敲除或沉默非編碼基因MALAT1 對腫瘤的發生、發展有著明顯的抑制作用。 同時MALAT1 可以競爭性地結合miRNA， 使miRNA 與靶基因的結合減少[11]， 而上調MALAT1 的表達可以使得miR-101減少，可以促進癌細胞增殖并減少癌細胞凋亡率[12]。提示敲除非編碼基因MALAT1 可能抑制腫瘤的轉移和侵襲，改善患者預后。

綜上所述，通過沉默lncRNA MALAT1 表達能夠抑制癌細胞增殖，降低侵襲，增加凋亡。 其作用機制可能涉及P13K/Akt 信號通路和EZH2/βcatenin 信號通路，以及相關蛋白的表達，在后續的動物實驗中將進一步探討lncRNA MALAT1 在腎細胞癌中的機制研究， 為臨床上腎透明細胞癌的診療提供新的思路。