基于16S rRNA 測序分析游泳運動對小鼠腸道菌群的影響

廖沁，曾來生，陳楊，劉星，蔣鑫萍，楊淙茗，謝雨，曾山，謝家和，

（1.贛南醫學院，贛州 341000；2.贛南醫學院第一附屬醫院心內科贛南醫學院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室國家老年疾病臨床醫學研究中心江西分中心，贛州 341000）

人類腸道微生物區系包含數千種不同的細菌分類群，以及各種古生菌、真核微生物和病毒，總計300 多萬個基因， 并蘊藏著巨大的新陳代謝能力[1]。 胃腸道中的微生物在營養吸收、維生素合成、能量獲取、 炎癥調節和宿主免疫反應中發揮重要作用[2-3]。 反過來，許多內在和外在因素可以影響腸道微生物，比如妊娠[4]、年齡[5]、飲食[6-7]等因素。 另外腸道—腦軸[8]、腸道—肌軸[8]和腸道—肝軸[9]的發現，表明腸道微生物和宿主外周組織之間存在雙向通信。

眾所周知，運動對心肺健康、肌肉力量、葡萄糖代謝、免疫系統和心理健康都有積極的影響[10]。 研究表明， 運動和腸道微生物區系組成之間存在聯系[11]。越來越多的研究揭示了微生物區系對運動成績、康復和疾病模式的各種指數有間接影響，例如通過肌動因子和其他細胞因子發出信號， 調節下丘腦—垂體—腎上腺軸的激活， 以及影響與運動相關的代謝途徑[12-14]。 研究還表明了運動個體腸道微生物區系組成的特殊特征[13]以及運動對久坐人群腸道微生物區系組成的影響[14]。研究還明確了運動對不同年齡不同性別個體的腸道微生物區系的有益影響[15-17]。

然而， 這些結果只能證實運動和微生物種群之間的關聯， 并不能確定運動和腸道菌群改變的因果關系。 此外研究大多集中在運動員和社會人群，由于性別、年齡、運動模式和強度等因素的差異，導致實驗結果存在一定的爭議性。 在人體內發現有氧運動影響腸道菌群[18]，但是鮮有研究報道游泳運動對小鼠腸道菌群的改變。 本實驗將探究游泳運動對小鼠腸道菌群的影響， 進而從腸道菌群的角度對運動給人體帶來的改變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康8 周齡的雄性C57BL/6 雄鼠，體重（27.72±0.91）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司浙江倉， 動物許可證號：SCXK （浙）2019-0001。 小鼠按12 h∶12 h 人工明暗周期，早上六點開燈，動物房溫度（24±1）℃，4 只/籠飼養在贛南醫學院SPF 級動物房， 給予充足的水和標準飼料喂養。 小鼠隨機分為游泳組和靜坐組，每組8只。

1.2 游泳方案 在30～32 ℃的150 cm × 70 cm 的錐形水缸中裝滿＞25 cm 的水，第一天游泳持續10 min，每天遞加10 min，直至一周后游泳90 min，總計28 d。上午下午各一趟。所有游泳時間均在9:00 AM-11:00 AM,及3:00 PM-5:00 PM。 同時，將靜坐組的小鼠關在籠子里作為對照。

1.3 腸道菌群樣本取材 游泳運動結束四周后，將待取樣的小鼠放進干凈的鋪有無菌濾紙的籠子里，小鼠排便后立即收集糞便樣本，單個小鼠收集3～5 粒糞便置于無菌的EP 管。 每只小鼠更換新的無菌濾紙和籠子。 取得糞便后液氮速凍，-80 ℃保存，用于腸道菌群16s rRNA 測序。

1.4 小鼠糞便微生物總DNA 提取和16S rRNA 基因測序

1.4.1 腸道菌群樣本DNA 提取 腸道樣本用E.Z.N.A.Stool DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒提取DNA，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA 進行定量。

1.4.2 16S rRNA 的擴增 16S rRNA 基因指的是基因組中編碼核糖體16S rRNA 分子對應的序列。 該基因全長約1542 bp， 由9 個可變區和10 個保守區組成（可變區為V1 到V9），其中保守區反映了生物物種間的親緣關系， 而可變區則表明物種間的差異，且變異程度與細菌的系統發育密切相關，被認為是最適于細菌系統發育和分類鑒定的指標。對16s rRNA 的V3-V4 可變區進行PCR 擴增，擴增引物為341F:5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和805R:5'-GACTA CHVGGGTATCTAATCC-3'；V4可變區擴增引物為515F:5'-GTGYCAGCMGCCG CGGTAA-3' 和806R：5'- GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'；V4-V5 可變區擴增引物為F：5’-GTGC CAGCMGCCG CGG-3’和R:5’-CCGTCAATTCMTT TRAGTTT-3’； 以及古菌的擴增引物為F:5’-GYG CASCAGKCG MGAAW-3’和R:5’-GGACTACHVG GGTWTCTAA T-3’。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳確證。

1.4.3 文庫構建和上機測序 PCR 產物由AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics, Danvers,MA, USA)純化，Qubit(Invitrogen, USA)定量。擴增子池用于測序， 擴增子文庫的大小和數量分別在Agilent2100 生物分析儀(Agilent，美國)和Illumina(Kapa Biosciences, Woburn, MA，美國)的文庫定量試劑盒上進行評估。使用NovaSeq6000 測序儀進行2×250bp 的雙端測序， 相應試劑為NovaSeq 6000 SPReagentKit(500cycles)。

1.5 數據處理與統計分析

1.5.1 篩選與質控 樣品在Illumina NovaSeq 平臺上按照制造商的建議進行測序， 由LC-Bio 提供。根據樣品獨特的條形碼， 將配對端序列分配給樣品，并將建庫引入的barcode 和引物序列去除。 使用FLASH 合并匹配端讀取。

1.5.2 生信分析 根據fqtrim(v0.94)，在特定的過濾條件下對原始讀數據進行質量過濾， 以獲得高質量的clean 標簽。 使用Vsearch 軟件對嵌合序列進行過濾(v2.3.4)。 利用DADA2 進行解調，然后使用ASVs (Amplicon Sequence Variants)的概念構建類OTU(Operational Taxonomic Units)表，獲得最終的feature 特征表以及特征序列，進一步進行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。 多樣性和多樣性通過歸一化到相同的隨機序列來計算。 然后根據SILVA(release 132)分類器，利用每個樣本的相對豐度對特征豐度進行歸一化。 Alpha 多樣性用于分析樣本物種多樣性的復雜性，通過QIIME2 計算5 個指標，包括Chao1、Observed、species,Goods coverage、Shannon、Simpson。 Beta 多樣性基于QIIME2 計算。采用Blast 進行序列比對， 每個代表性序列用SILVA 數據庫對特征序列進行注釋。其他圖是用R包（V3.5.2）實現的。

1.5.3 統計學分析 采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。 實驗結果以（±s）表示,兩組間比較采用t 檢驗。 以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 運動對腸道菌群物種組成豐度的分析 圖1是兩組基于一致性進行繪制的稀釋曲線， 曲線趨于平緩，證明本實驗測序數據量已飽和，即測序數據合理，可以反映樣本中大多數的微生物信息。 進而對兩組小鼠腸道糞便的樣本進行測序， 統計運動后OUT 數量， 用Venn 圖展示不同組之間共有和差異的OTU 數目。 由圖2 可知，靜坐組OTU 數目為1658，運動組數目為821，共有數目為707。結果表明運動組OTU 數目明顯降低， 提示游泳運動可能降低菌群豐富度。

圖1 靜坐組和運動組的稀釋曲線

圖2 靜坐組和運動組腸道菌群OUT 的Venn 圖

2.2 運動對腸道菌群Alpha 多樣性的分析 α 多樣性是度量單個樣本內有多少種微生物物種， 以及每個物種所占比例的指標， 關注的是樣本自身的菌群豐富度和均勻度。 靜坐組和運動組的腸道菌群微生物的Alpha 多樣性分析表明，圖3 顯示反映樣本中物種豐富度的Observed species 有統計學差異（P<0.05）。

圖3 靜坐組和運動組腸道菌群Alpha 多樣性比較

2.3 運動對腸道菌群Beta 多樣性的分析 Alpha多樣性與Beta 多樣性一起構成了總體多樣性或一定環境群落的生物異質性，Beta 多樣性是指不同環境群落之間的物種差異性。 圖4 是通過主成分PCA（Principal Component Analysis)對靜坐組和運動組的腸道菌群進行分析。 結果顯示靜坐組菌群明顯聚集，并且與運動組有一定的距離，說明兩組之間有一定的差異。 于是對兩組的腸道菌群進行門水平分析，結果如圖5 所示，靜坐組和運動組的前三優勢菌群都是擬桿菌門， 厚壁菌門以及變形菌門。 這表明運動對腸道菌群的結構組成沒有明顯影響，但是運動導致擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門以及變形菌門豐度增加。

圖4 靜坐組和運動組腸道菌群的PCA 分析

圖5 靜坐組和運動組腸道菌群門水平相對豐度比較

進一步對腸道菌群進行屬水平分析，結果見圖6。 與靜坐組的優勢菌群相比，運動組的擬桿菌屬、杜氏藻屬下降，但是有益菌乳酸菌屬、毛螺菌屬明顯上升。

圖6 靜坐組和運動組腸道菌群屬水平相對豐度比較

2.4 顯著差異菌群分析 為了進一步探究運動和靜坐組之間的差異物種， 對腸道菌群物種進行LEfSe （Linear Discriminant Analysis Effect Size）分析，尋找生物標記物。 結果如圖7 所示，主要展示了LDA score 大于預設值（>2）的顯著差異物種，即不同組間顯著差異物種的影響程度，數值越大，差異越顯著。 此外運動組屬水平上遲緩埃格特菌屬、另枝菌屬、克里斯滕森菌屬、真桿菌屬、瘤胃球菌-UCG-013、瘤胃球菌-UCG-014 以及異桿菌屬豐度明顯高于靜坐組， 在科水平上真桿菌科和瘤胃球菌科的豐度也高于靜坐組。

圖7 LEfSe 及LDA 值分布柱狀圖

2.5 腸道菌群功能預測 對兩組腸道菌群進行KEGG 功能分析，并篩選出具有顯著性組間差異的通路。 根據組間t-test 差異檢驗，有統計學意義的通路結果見圖8。運動組集中在UDP-N-acetyl-Dglucosamine biosynthesis I、superpathway of polyamine biosynthesis I、1,4 -dihydroxy -6 -naphthoate biosynthesis II、peptidoglycan maturation、superpathway of glycol metabolism and degradation、pyrimidine deoxyribonucleotides de novo biosynthesis III等通路。 而靜坐組集中在superpathway of Lthreonine biosynthesis、superpathway of β-Dglucuronide and D -glucuronate degradation、superpathway of 5 -aminoimidazole ribonucleotide biosynthesis、superpathway of hexuronide and hexuronate degradation 等通路。

圖8 t-test 組間通路差異分析圖

3 討論

3.1 游泳運動對小鼠腸道菌群微生物組成的影響運動可以影響人體腸道菌群的數量和構成[19]，Carbajo 等[20]研究證明運動可以改變大鼠的腸道菌群。 本研究同樣發現，游泳運動改變了小鼠腸道菌群的豐度及比例。 運動組小鼠的菌群豐富度降低，體現在有害菌的減少以及有益菌的增加。 其中擬桿菌門豐度降低， 而厚壁菌門和變形菌門的豐度增加。 與肥胖相關的腸道微生物區系的特征是擬桿菌的減少[21]。 Akoi 等[22]發現厚壁菌門/擬桿菌門的比值和運動量正相關。 腸道厚壁菌門可以產生丁酸鹽抵抗患結腸癌的風險[23]。而有益的腸道變形菌門在人類非酒精性肝病中降低[24]。本研究證明了游泳運動可以調節菌群構成和種類， 抑制致病菌的產生，增加益生菌的定植。

在菌屬水平上，和靜坐組相比，運動組的乳酸菌屬和毛螺菌屬明顯上升。 其他研究也證實運動導致乳酸菌和毛螺菌表達增加[25-26]。 乳酸菌是功能已經確認的益生菌， 可以改善嚙齒類動物在力竭運動后的腸道屏障性能[27]和抗氧化狀態[28]，并減輕炎癥反應[29]。另有學者發現老年缺血性心肌病患者乳酸菌水平顯著降低[30]。而毛螺菌屬可以介導過敏反應[31]、增加食欲[32]以及抵抗兒童腹瀉[33]。我們的實驗說明游泳運動可以影響和改善宿主腸道菌群的結構和功能。 但是值得注意的是，這種菌群的變化可能是暫時的， 或許需要長期重復的運動來使腸道菌群發生持久的改變。

另外我們還發現了運動組腸道菌群的遲緩埃格特菌屬、另枝菌屬、真桿菌屬、Ruminococcaceae-UCG-013、Ruminococcaceae-UCG-014、 克里斯滕森菌屬以及異桿菌屬豐度也明顯高于靜坐組。 研究報道低水平的遲緩埃格特菌和老年人的脆弱指數正相關[34]，并且與生物學年齡呈正相關，與實際年齡無關[35]。而另枝菌屬在線粒體障礙模擬的衰老模型中表達增加[36]，不過我們的實驗結果表明游泳運動過后小鼠腸道中另枝菌屬表達也升高， 結合其他不同的獨立實驗， 我們推測同樣的菌群在不同的模型中的表達和作用也有所區別。Ruminococcaceae-UCG-013 在雞球蟲病感染中明顯 降 低[37]， 而Ruminococcaceae-UCG-014 的 增 加可以減緩焦慮情緒[38]，使人體免受負面情緒的干擾。 自閉癥患者治療前后的腸道菌群也有上述改變[39]。我們的實驗同樣觀察到游泳運動的小鼠更為興奮并且有活力， 這或許提示小鼠上述表型的改變和運動優化腸道菌群的組成有關。 在不同的人群和多項研究中， 腸道克里斯滕森菌的相對豐度和身體質量指數（BMI）成負相關，并且與肥胖和炎癥性腸病等疾病有關[40]。 另外異桿菌可以參與3-羥基十八烯酸對結腸炎的治療[41]。在科水平上真桿菌科和瘤胃球菌科的豐度在運動組也顯著增加。真桿菌科持續存在于纖維溶解的腸道群落中，是健康腸道微生物區系的重要組成部分， 而在炎癥性腸病患者中可以觀察到它們的耗竭。 此外瘤胃球菌科因其對人體的有益作用而廣為人知， 比如與長壽[42]、心臟代謝[43]、骨關節炎[44]、肺癌[45]和帕金森病[46]等有關。以上結果證明運動有助于提高腸道菌群的健康程度， 或許運動可以通過調節腸道微生物從而防治胃腸道，神經和心血管等疾病。

3.2 游泳運動對小鼠腸道菌群微生物基因功能的影響 腸道菌群的功能和宿主之間存在緊密聯系，腸道微生物除能夠合成蛋白質外， 還可以合成多種維生素， 其代謝產物還會在腸道內有一定的作用，這與機體的免疫息息相關[47]。 本實驗根據KEGG功能分析發現， 運動組表達增加的通路主要集中在葡萄糖無氧氧化途徑，乳酸代謝，蛋白質合成，脂代謝和信號傳導， 而正常組豐度增加的通路主要有葡萄糖有氧氧化途徑和遺傳信息。 說明運動時，機體需要更多的能量來維持消耗，包括利用蛋白質脂肪等，并且由于瞬時大量的運動，部分葡萄糖更多地參與了無氧氧化。 我們的研究還發現運動會激活部分信號傳導通路， 進而促進腸道菌群發揮代謝作用， 并以此來調控其他器官或組織對運動的反應。

綜上所述， 運動作為非藥物和無創的治療手段，在改善腸道菌群結構和組成、調節人體腸道微環境的穩態等方面具有積極的作用和獨特的意義。 本實驗證明了游泳運動可以增加小鼠腸道菌群中健康的細菌種類、微生物多樣性、能量代謝能力和微生物相關的代謝物。 游泳運動還可以通過調節菌群變化進而改善負面情緒。 本研究可以讓人們對運動和腸道微生物有進一步的認識， 并對運動對人體的好處有更深刻的理解。 有望為全民體育運動提供理論指導。 但是本實驗還存在樣本量不夠，小鼠和人體的腸道存在一定差異的問題。因此仍需要更深層次地去探討運動和腸道菌群的關系。