葛根中內源性組分葛根素的生物效應

郭 嫻，郭 嵐，徐夢佳，陳錦萍，萬益群

(南昌大學化學學院，江西 南昌 330031)

葛根(RadixPueraria)，又名甘葛、粉葛、葛藤等，是豆科植物葛的塊根。我國是葛類植物的主要生產地，資源豐富，主要分布在湖北、湖南、山西等地區[1-2]。葛根是一種常用的中藥，味甘性涼。據《本草綱目》記載：“葛根乃陽明經藥，兼入脾經，脾主肌肉......野葛性甘、辛、涼。有解肌退熱，透滲，生津止渴，升陽止瀉之功。常用于表證發熱，項背強痛，麻瘆不透，熱病口渴，陰虛消渴，熱瀉熱痢，脾虛泄瀉”[3-4]。現代藥理研究表明，葛根具多重生物活性，如抗炎[5]、降血壓[6]、降血糖[7]、抗腫瘤[8]以及抗氧化等作用[9]。有研究表明,葛根中主要含有葛根苷、香豆素、生物堿、三萜類化合物、氨基酸以及異黃酮類化合物等組分[10-11]，其中以異黃酮類物質含量最多，主要包括葛根素、大豆苷和大豆苷元等。在日常生活中，葛根也可作為食品來使用。

隨著葛根的廣泛應用，其安全性也受到人們的廣泛關注，有關其不良反應的報道逐漸增多。張玲[12]等人對國內1994年以來關于葛根素注射劑所導致溶血反應的27篇病例報道中的48例病人進行分析，發現溶血反應多發生于以往曾用過葛根素或連續用藥一周以上的病人，以急溶血性貧血為主要表現，血液免疫學檢查可見葛根素特異性抗體。許焱[13]等人研究發現，葛根素可導致急性腎衰竭，其機制可能為多方面的，但主要為腎小管壞死，與此同時，免疫復合物在腎臟沉積誘發炎癥反應引起腎小球及腎間質損傷，也可能同時使腎衰竭加重。朱玉珍[14]等在一例葛根素注射液引起急性溶血和腎衰竭的病例中，分別做了直接、間接抗球蛋白實驗，實驗結果顯示，葛根素進入體內后與組織細胞膜松散結合，形成一種異己抗原，使敏感個體產生相應的藥物抗體，病人紅細胞嚴重受到損害。我國食品藥品監督管理局在2004年11月發布了“關于修訂葛根素注射劑說明書的通知”，要求相關企業盡快修訂說明書和包裝標簽，并要求生產企業、醫生和患者高度重視葛根素引起的嚴重不良反應等[15]。因此，系統地研究評估葛根中的主要組分葛根素的毒性，對合理食用葛根具有重要的指導意義。

本文以Balb/c小鼠作為實驗動物，根據《中國藥典》2020年版規定，葛根中主要功效成分為葛根素，且含量不得少于2.4%，成年人每日葛根臨床用量約為10-15 g，即每公斤體質量成人對葛根素的攝入量約為4～6 mg[4]。以成人對葛根素的最大攝入量為基準，小鼠與人體表面積折算系數約為9.01[16]來確定給藥劑量，通過急性經口毒性實驗，探究一定劑量的葛根素對小鼠的主要臟器(包括肝臟、腎臟、心臟)的影響，為正確使用葛根提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

葛根素(AR，95%)購自上海源葉生物公司；谷草轉氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、谷丙轉氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、總膽紅素(Total Bilirubin,T-BIL)、間接膽紅素(Indirect Bilirubin,I-BIL)、直接膽紅素(Direct Bilirubin,D-BIL)、肌酐(Creatinine,CREA-J)、尿酸(Uric Acid,UA)、尿素(Urea,UREA)、乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)、羥丁酸脫氫酶(Hydroxybutyric Dehydrogenase,HBDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Isoenzyme,CK-MB)等試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；二甲苯、鹽酸和氨水(AR)購自國藥集團化學試劑有限公司；10%福爾馬林中性固定液購自雨露實驗器材有限公司；聚乙二醇400(PEG 400，AR)購自天津恒興試劑有限公司；蘇木素-伊紅染液購自武漢市皮諾飛生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

GL-21M型冷凍離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BS-380型全自動生化分析儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機和JB-L5型凍臺均購自武漢俊杰電子有限公司；RM2016型病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；KD-P型組織攤片機購自金華市科迪儀器設備有限公司；10212432C型載玻片及蓋玻片購自江蘇世泰儀器制造有限公司；NIKON ECLPSE CI型正置光學顯微鏡和NIKON DS-U3型成像系統均購自日本尼康有限公司。

1.3 實驗動物

健康級Balb/C種小白鼠，雌雄各半，4～6周齡，體重(20±2)g，由南昌市樂悠生物科技有限公司提供。在試驗前所有小鼠均適應環境7 d，溫度控制在(24±2)℃，相對濕度為55%±10%，自由飲水進食，光照條件為12 h白晝，12 h黑夜。

1.4 方法

1.4.1 毒性評估實驗

健康級Balb/C小鼠20只，按性別、體重隨機分為2組，即為對照組和給藥組，每組10只，雌雄各半，雌雄分籠飼養。給藥組灌胃葛根素，劑量為6000 mg·kg-1，對照組灌胃等體積的聚乙二醇 400(PEG 400)。以上各組小鼠均按體質量10 mL·kg-1灌胃一次。小鼠在給藥前禁食不禁水12 h，給藥后常規飼養，持續觀察7 d。每天觀察小鼠的飲食情況、毛色狀況、精神狀態等一般行為，并記錄小鼠的體重。若小鼠出現死亡情況，將立即對小鼠進行解剖，并肉眼觀察小鼠主要臟器病理形態變化。7 d后對小鼠進行眼眶靜脈叢處取血并處死，血液進行生化分析，分離完整的心臟、肝臟和腎臟，用生理鹽水清洗后濾紙吸干，進行稱重，然后將組織固定在10%福爾馬林中性固定液中，進行組織病理學研究。

1.4.2 小鼠血清分析

各組小鼠在實驗第7 d后禁食不禁水12 h處死。經小鼠眼眶靜脈叢取血，待血液靜置1 h后于4℃、3000 r·min-1的條件下離心。分離的血清樣本用全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(T-BIL)、直接膽紅素(D-BIL)、間接膽紅素(I-BIL)、尿素(UREA)、尿酸(UA)、肌酐(CREA-J)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和羥丁酸脫氫酶(HBDH)等生化指標的含量。

1.4.3 組織病理學研究

小鼠取血后脫頸處死并解剖，取出其心臟、肝臟、腎臟，并肉眼觀察有無異常變化。在稱重后用10%福爾馬林固定液固定24 h以上后進行脫水、包埋、切片、蘇木素伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下進行病理學形態研究。

1.4.4 統計學分析

應用SPSS26.0版統計軟件對實驗數據進行分析，各組計量數均以ˉX±S表示，采用單因素方差分析考察其顯著性，組間進行兩兩比較，采用LSD方法，以P<0.05為差異具有統計學意義，以P<0.01為差異非常顯著。

2 結果與討論

2.1 小鼠體質量的影響

對小鼠飲食和活動情況進行了觀察。對照組和給藥組有若干只小鼠在灌胃后當天出現行動遲緩、炸毛等癥狀，且在4 h后癥狀消失，其他小鼠未出現異常癥狀，且在7 d觀察期內，未出現小鼠死亡情況，并且各小鼠進食飲水、毛色狀態和行動狀況均正常，說明葛根素對小鼠的一般生長情況沒有較大影響。

在實驗期間對小鼠進行了稱重，并對各組數據進行了統計分析，結果見表1。結果表明，與對照組比較，給藥組小鼠在灌胃葛根素前后體質量未出現顯著性差異(P>0.05)，表明葛根素對小鼠正常的生長情況無影響。

表1 葛根素對小鼠體重變化的影響(n=5)

2.2 小鼠主要臟器指數的影響

臟器指數是小鼠臟器與體重的比值，當小鼠臟器系數增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。因此本實驗對各組小鼠的主要臟器指數進行了分析，結果見表2。結果表明，與對照組相比，給藥組小鼠的心臟、肝臟、腎臟指數均無顯著性差異(P>0.05)，表明葛根素對小鼠臟器指數無明顯影響。

表2 葛根素對小鼠臟器指數變化的影響(n=5)

2.3 小鼠肝功能、腎功能和心功能的影響

對小鼠血清的各生化指標(包括肝功能、腎功能和心功能指標)按1.4.2方法進行分析。結果表明，與對照組小鼠比較，給藥組雌性小鼠尿素(UREA)含量由5.80顯著上升至 6.93 mmol·L-1(P<0.05，見圖1-a)；給藥組雌雄小鼠心臟生化指標LDH水平由472.60和520.60 U·L-1分別下降至411.15和 300.21 U·L-1(P<0.01，見圖1-b)；給藥組雄性小鼠血清中HBDH含量由193.60顯著下降為130.01 U·L-1(P<0.01，見圖1-c)；而其他各生化指標值與對照組相比均沒有顯著的差異。因上述結果表明，當小鼠灌胃該實驗劑量的葛根素后，小鼠的一些腎功能指標和心功能指標會發生一些變化。

注：*表示與對照組之間具有顯著性差異(P<0.05)；#表示與對照組之間差異十分顯著(P<0.01)。

2.4 小鼠臟器組織病理分析

對小鼠的臟器(包括肝臟、心臟和腎臟)按1.4.3方法進行處理，并進行病理學形態研究，結果見圖2-圖4。由圖2可見，對照組雌雄小鼠的肝臟和給藥組雌雄小鼠的肝臟均呈現一定程度的嗜酸性變，因此相比對照組小鼠肝臟而言，給藥組雌雄小鼠肝臟基本沒有受到損傷；由圖3可見，給藥組雌雄小鼠心臟除存在局灶嗜酸性變外還伴有部分心肌溶解，周圍心肌細胞壞死；由圖4可見，對照組雌雄小鼠腎臟存在少許嗜酸性變，而給藥組雌雄小鼠存在局灶嗜酸性變和腎小管間質局灶性出血。以上病理學形態分析結果表明，該實驗劑量的葛根素對小鼠的肝臟幾乎不產生影響，而對小鼠的心臟和腎臟均有一定程度的影響。

a-對照組雄性；b-對照組雌性；c-給藥組雄性；d-給藥組雌性。

a-對照組雄性；b-對照組雌性；c-給藥組雄性；d-給藥組雌性。

a-對照組雄性；b-對照組雌性；c-給藥組雄性；d-給藥組雌性。

3 結論

對小鼠一次性灌胃劑量為6000 mg·kg-1葛根素后，各組小鼠一般活動狀態良好，且未出現死亡。進一步對小鼠血清的各生化指標進行分析，結果表明，雌性小鼠的腎臟生化指標UREA水平顯著低于對照組雌性小鼠，且給藥組雄性小鼠心臟生化指標LDH、HBDH和雌性小鼠的LDH值與對照組相比顯著降低。對小鼠心臟、肝臟和腎臟進行組織病理學分析，結果顯示該劑量的葛根素對小鼠心臟及腎臟具有較輕微影響。因此，本文實驗劑量6000 mg·kg-1為大于葛根臨床劑量的100倍。由實驗結果可知，此劑量下葛根素的攝入量對人體健康沒有影響。以上研究結果為葛根素進一步慢性毒性實驗提供了重要的實驗依據，并為指導人們安全使用葛根提供了一定的理論依據。