鱟血藍蛋白的分離純化及其酚氧化酶活性的初步研究

劉永豪，張干歡，董鴻睿，康信煌，張國光，吳育廉，鄧春梅

(廣東海洋大學化學與環(huán)境學院，廣東 湛江 524088)

血藍蛋白是存在于節(jié)肢動物(螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛類)和軟體動物(腹足類和頭足類)血淋巴中含有2個銅離子的呼吸蛋白，它是一種負責運輸氧的大分子多聚體，與氧結(jié)合時呈藍色，脫氧狀態(tài)下呈無色[1]。血藍蛋白功能甚多，除了具有輸氧功能，還具有酚氧化酶活性[2-4]、抗菌活性[5]、抗腫瘤活性[6]、凝集活性[7]等多種非特異性免疫學活性。研究證實，血藍蛋白的物化性質(zhì)、基因序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與酚氧化酶非常相似[8]，均具有2個銅離子結(jié)合區(qū)CuA和CuB，它們與6個組氨酸連接在一起，形成一個可以與酚類底物結(jié)合的活性中心。酚氧化酶通過這個銅-氧結(jié)合位點，將鄰苯二酚進一步催化生成鄰苯二醌，在植物和節(jié)肢動物體內(nèi)合成黑色素和排除異己成分發(fā)揮著重要的作用。目前，國內(nèi)外學者對血藍蛋白的研究主要集中在凡納濱對蝦、蟹類和其它甲殼動物，而對鱟血藍蛋白的研究甚少。研究[9]發(fā)現(xiàn)，鱟血漿中血藍蛋白的含量很高，占血漿總蛋白的90%～95%。因此，作者基于一種酚氧化酶活性蛋白的制備方法[10]，分離純化鱟血藍蛋白，探究其表達酚氧化酶活性的影響因素，為充分利用珍貴的鱟血漿資源提供重要的實驗依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

中國鱟血漿，湛江博康海洋生物有限公司。

透析袋(MW=3500)；Sephacryl S-100丙烯葡聚糖凝膠、牛胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯亮藍G-50、鄰苯二酚、十二烷基磺酸鈉(SDS)、脲(尿素)、硫酸銨、溴酚藍、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鎂等試劑均為國產(chǎn)分析純；考馬斯亮藍R-250，優(yōu)級純。

電子分析天平；DNM-9606型酶標儀；PHS-2F型pH計；臺式高速冷凍離心機；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器；HL-2B型數(shù)顯恒流泵；HD-1型核酸蛋白檢測儀；HR/T20M型臺式冷凍干燥機；TU-1810型紫外可見分光光度計；SPH-100B型恒溫培養(yǎng)搖床；DYY-6C型電泳儀。

1.2 鱟血藍蛋白的分離純化

采用飽和硫酸銨鹽析法初步純化鱟血漿蛋白，低溫高速離心，去上清，將沉淀溶于0.1 mol·L-1PBS緩沖液，通過透析袋透析除鹽、丙烯葡聚糖凝膠柱層析純化，得到鱟血藍蛋白。

1.3 紫外可見吸收光譜分析及SDS-PAGE分析

紫外可見吸收光譜分析：將純化后的鱟血藍蛋白溶于0.1 mol·L-1PBS緩沖液，采用紫外可見分光光度計在250～600 nm波長范圍內(nèi)掃描。

SDS-PAGE分析：取純化后的鱟血藍蛋白溶液，加入聚乙二醇濃縮，按常規(guī)方法將濃縮后的鱟血藍蛋白進行SDS-PAGE分析(12%分離膠，5%濃縮膠)，使用考馬斯亮藍R-250進行染色，然后加入脫色液進行脫色，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶為止。

1.4 考馬斯亮藍法(Bradford法)[11]測定鱟血藍蛋白濃度

以0.2 mg·mL-1牛血清白蛋白溶液為標準蛋白液，分別吸取0 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL牛血清白蛋白溶液，加蒸餾水補至1 000 μL，加入5 mL考馬斯亮藍G-50溶液，混勻后，測定595 nm處吸光度，繪制標準曲線。

取純化后的鱟血藍蛋白，同法測定595 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線的線性回歸方程計算鱟血藍蛋白的濃度。

1.5 鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的測定

參照文獻[12]測定鱟血藍蛋白酚氧化酶活性。將50 μL鱟血藍蛋白加入到100 μL 0.1 mol·L-1的PBS緩沖液中，恒溫振蕩30 min；加入50 μL鄰苯二酚，混勻，記錄每分鐘溶液在405 nm處吸光度(OD405)變化[13]；用蒸餾水代替鱟血藍蛋白作為對照組，各組平行測定3次。

酚氧化酶活力單位定義：以鄰苯二酚為底物，通過測定其被酚氧化酶氧化后的產(chǎn)物黑色素的生成量來確定酚氧化酶活力，每分鐘每毫升鱟血藍蛋白在實驗條件下OD405值增加0.001為1個酶活力單位(U·min-1·mL-1)[14-15]。

1.6 鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響因素分析

1.6.1 單因素實驗

采用單因素實驗分別考察pH值(5.7、6.0、6.4、6.6、6.8、7.0、7.4、7.7、8.0)、溫度(25 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)、鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比(0.3∶1、0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1)、時間對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響，每組實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.6.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，固定恒溫振蕩時間為30 min，以溫度、pH值、鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比、時間為自變量，設計4因素3水平響應面實驗，對鱟血藍蛋白酚氧化酶的影響因素進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鱟血藍蛋白的紫外可見吸收光譜(圖1)

從圖1可知，280 nm處存在蛋白質(zhì)吸收峰，340 nm處存在銅離子和氧離子結(jié)合的特有吸收峰，且280 nm處的吸收峰強度大于340 nm處的，這是鑒別血藍蛋白的特征之一[4]。

圖1 鱟血藍蛋白的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of hemocyanin from Limulus

2.2 鱟血藍蛋白的SDS-PAGE圖譜(圖2)

1,2.純化的鱟血藍蛋白 M.marker

從圖2可以看到2條分子量相近的條帶，說明純化的鱟血藍蛋白有2個亞基，與標準蛋白比較，其分子量約為66 kDa，為典型的節(jié)肢動物血藍蛋白。

2.3 鱟血藍蛋白的濃度

對牛血清白蛋白的標準曲線(圖3)進行擬合，得到線性回歸方程為y=7.429x+0.0146。測得鱟血藍蛋白溶液的吸光度為0.502，依據(jù)線性回歸方程計算得到鱟血藍蛋白濃度為0.065 6 mg·mL-1，由于原樣稀釋了50倍，因此，純化后的鱟血藍蛋白濃度為3.28 mg·mL-1。

圖3 牛血清白蛋白的標準曲線Fig.3 Standard curve of bovine serum albumin

2.4 單因素實驗結(jié)果

2.4.1 pH值對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響(圖4)

圖4 pH值對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of pH value on phenoloxidase activity of hemocyanin from Limulus

由圖4可知，隨著pH值的增大，鱟血藍蛋白酚氧化酶活性呈先升高后降低的趨勢，當pH值為6.7時，酶活性達到最高。因此，選擇6.7作為響應面實驗pH值的中心點。

2.4.2 溫度對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響(圖5)

圖5 溫度對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on phenoloxidase activity of hemocyanin from Limulus

由圖5可知，溫度對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響較為顯著，隨著溫度的升高，酶活性呈先升高后降低的趨勢，當溫度為36 ℃時，酶活性達到最高；繼續(xù)升高溫度至50 ℃時，幾乎無活性。因此，選擇36 ℃作為響應面實驗溫度的中心點。

2.4.3 鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響(圖6)

圖6 鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of concentration ratio of 1,2-benzenediol to hemocyanin from Limulus on phenoloxidase activity of hemocyanin from Limulus

由圖6可知，隨著鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比的增大，即底物鄰苯二酚濃度的增大，鱟血藍蛋白酚氧化酶活性呈先升高后降低的趨勢，當濃度比為1.5∶1時，酶活性達到最高。因此，選擇1.5∶1作為響應面實驗鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比的中心點。

2.4.4 時間對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響

酶活力的含義是指酶催化底物反應的初速度[16]，當?shù)孜餄舛茸銐虼髸r，酶催化底物反應的速度達到最快，此時生成的產(chǎn)物濃度與特定期間的反應時間呈一定的線性關系，擬合曲線的斜率反映酶的活性[17]。測定鱟血藍蛋白酚氧化酶活性在30 min和10 min內(nèi)的表達情況，結(jié)果如圖7所示。

圖7 鱟血藍蛋白酚氧化酶活性在30 min(a)、10 min(b)內(nèi)的表達情況Fig.7 Expression of phenoloxidase activity of hemocyanin from Limulus during 30 min(a) and 10 min(b)

由圖7a可知，在30 min內(nèi)，OD405-t曲線整體呈拋物線，吸光度與時間呈線性相關，隨著時間的延長，OD405值逐漸升高，且OD405值升幅越來越小并逐漸趨于平緩。為了探究酶活性的最佳表達時間，測定10 min內(nèi)酶活性(圖7b)，發(fā)現(xiàn)在3 min時，OD405-t曲線線性程度最高，斜率達到最大值。因此，選擇3 min作為響應面實驗時間的中心點。

2.5 響應面實驗結(jié)果

2.5.1 響應面實驗設計與結(jié)果(表1)

表1 響應面實驗設計與結(jié)果Tab.1 Design and results of response surface methodologies

2.5.2 回歸模型的建立與方差分析

運用Design-Expert軟件對響應面實驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到多元二次回歸模型方程為：Y=68.00+4.18A-0.0250B+5.00C-11.70D+2.10AB-4.17AD-5.00BC-11.68BD-18.59A2-10.66B2-9.20C2+1.20D2。

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表2。

表2 回歸模型的方差分析Tab.2 Variance analysis of regression model

由表2可知，該模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著，回歸模型方程R2=0.9937，說明該模型與實際實驗的誤差小，回歸模型的擬合度較好，采用此模型探究鱟血藍蛋白酚氧化酶活性最佳表達條件是合理可行的。時間對酶活性的影響極顯著(P<0.01)；溫度、鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比對酶活性的影響顯著(P<0.05)；pH值對酶活性的影響不顯著。各因素對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的影響大小為：時間>鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比>溫度>pH值。

2.5.3 響應面分析

響應面圖和等高線圖能直觀地反映各因素交互作用與鱟血藍蛋白酚氧化酶活性之間的關系，響應面越陡，表示影響越顯著；等高線趨于圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形或馬鞍形則表示交互作用顯著[18]。各因素交互作用對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性影響的響應面圖如圖8所示。

圖8 各因素交互作用對鱟血藍蛋白酚氧化酶活性影響的響應面圖Fig.8 Response surface plot for effect of interaction between various factors on phenoloxidase activity of hemocyanin from Limulus

2.5.4 驗證實驗

由優(yōu)化后的模型可知，鱟血藍蛋白酚氧化酶活性最佳的表達條件為:溫度36.7 ℃、pH值6.8、鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比1.7∶1、時間2.1 min，在此條件下,測得鱟血藍蛋白酚氧化酶活性為83.3 U·min-1·mL-1，與預測值83.7 U·min-1·mL-1基本吻合，說明回歸模型與實際情況擬合較好。

3 結(jié)論

采用飽和硫酸銨鹽析法、透析除鹽和丙烯葡聚糖凝膠柱層析分離純化鱟血藍蛋白，純化后的鱟血藍蛋白在280 nm 、340 nm處有特征吸收峰，有2個蛋白亞基，分子量約為66 kDa，為典型的節(jié)肢動物血藍蛋白。在溫度為36.7 ℃、pH值為6.8、鄰苯二酚與鱟血藍蛋白濃度比為1.7∶1、時間為2.1 min的條件下,鱟血藍蛋白酚氧化酶活性最高，為83.3 U·min-1·mL-1。本研究得到的鱟血藍蛋白酚氧化酶活性的最佳表達條件，可應用于鱟的養(yǎng)殖，通過改變養(yǎng)殖條件人工誘導鱟血表達酚氧化酶活性，從而提高鱟的自身免疫力；也可以用于檢測器的設計，檢測環(huán)境中酚類物質(zhì)的含量。