一種ICT型熒光探針的光譜性質與識別機制研究

成 昭，鄭 蕾，徐 玥，何 昊

(西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021)

過渡金屬Zn、Cu、Hg廣泛參與代謝、信號轉導等生理過程，與生命體中氧化還原過程密切相關。研究Zn、Cu、Hg的分布、轉運與動態濃度變化，能夠為神經生理學與神經病理學提供重要信息。其中，Zn與認知活躍度的相關性較高[1-2]，其最大濃度分布出現于腦部；Cu具有兩種主要氧化態Cu+、Cu2+，存在于生命體中多種氧化還原路徑，Cu的異常積累已被證明參與了多種神經退行性疾病的致病機制[3-4]；此外，空氣、土壤、水體中過量分布的Cu和Hg不僅影響生態環境，還會通過食物鏈富集，經食源性攝入后危及人體健康。因此，有必要對環境中Zn2+、Cu2+、Hg2+進行定性定量檢測[5]。

使用小分子熒光探針進行目標物的識別與檢測時，能夠將探針-目標物分子水平的識別作用轉化為可調控的熒光信號，識別過程響應迅速、直觀可視。此外，熒光探針還具有檢測方法簡單、試樣用量少、檢出限低、線性響應等優勢[6-7]。因此，作者基于分子內電荷轉移(intramolecular charge transfer，ICT)機制進行探針結構設計[8-9]，引入多羧酸配體作為識別基團，以苯乙烯類發色團苯并咪唑作為熒光基團，合成得到乙酸甲酯型熒光探針S13，通過1HNMR、IR、MS對中間體及S13進行表征；然后對S13進行水解得到其Cs鹽形式T13，并將T13用于水環境中金屬離子(Zn2+、Cu2+、Hg2+)的識別，通過分析熒光強度與Zn2+、Cu2+、Hg2+濃度的線性關系，研究探針T13的光譜性質，并初步探究探針T13對Zn2+、Cu2+、Hg2+的識別機制。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

4-甲基-2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、溴乙酸甲酯、鄰苯二胺等均為市售化學純，未經純化直接使用。

XT-4型顯微熔點儀，北京泰克科技有限公司；TENSOR T-27型紅外分光光度計、AVANCE Ⅲ 400MHz型超導核磁共振波譜儀、microTOF-QⅡ ESI-Q-TOF LC/MS/MS型飛行時間質譜儀，美國布魯克科技有限公司；UV-1700型紫外分光光度計，日本島津制作所；LS-55型熒光分光光度計，美國鉑金埃爾默儀器有限公司。

1.2 探針S13的合成

以4-甲基-2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、溴乙酸甲酯、鄰苯二胺等為原料，經6步反應得到一種ICT型熒光探針S13，其合成路線如圖1所示。

圖1 探針S13的合成路線Fig.1 Synthetic route of probe S13

1.2.1 3-硝基-4-(2-氯乙氧基)甲苯(Ⅰ)的合成

將4-甲基-2-硝基苯酚(1.53 g，0.01 mol)、1-溴-2-氯乙烷(4.30 g，0.03 mol)與無水碳酸鉀(2.07 g，0.015 mol)均勻混合于DMF(8 mL)中，120 ℃反應5 h；冷卻，加入20 mL乙酸乙酯，水洗(10 mL)3次，蒸干溶劑，用甲醇-水重結晶，得到化合物Ⅰ。

1.2.2 1-(4-甲基-2-硝基苯氧基)-2-(5-甲基-2-硝基苯氧基)乙烷(Ⅱ)的合成

將化合物Ⅰ(2.15 g,0.01 mol)、5-甲基-2-硝基苯酚(1.53 g,0.01 mol)與無水碳酸鉀(2.50 g,0.018 mol)均勻混合于DMF(10 mL)中，140 ℃反應 4 h；冷卻，將反應混合物倒入20 mL冰水中，抽濾，水洗(10 mL)3次，用甲醇-水重結晶，得到化合物Ⅱ。

1.2.3 1-(4-甲基-2-氨基苯氧基)-2-(5-甲基-2-氨基苯氧基)乙烷(Ⅲ)的合成

將濃鹽酸(0.2 mL)與無水乙醇(10 mL)均勻混合，向其中加入還原鐵粉(3.36 g,0.06 mol)，80 ℃反應30 min，使鐵粉充分活化；再向其中分批加入化合物Ⅱ(3.32 g,0.01 mol)，80 ℃反應4 h；反應結束，用15%KOH-乙醇調節反應混合物pH值為7～8，過濾去除鐵粉；濾液中加入6 mol·L-1硫酸，析出白色硫酸鹽沉淀，過濾；沉淀溶于60 ℃熱水，用飽和氫氧化鈉溶液調節pH值為9～10，冷卻，抽濾，用甲醇重結晶，得到化合物Ⅲ。

1.2.4 2-[2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基]-5-甲基苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(Ⅳ)的合成

將化合物Ⅲ(2.72 g,0.01 mol)與MeCN(10 mL)均勻混合，加入二異丙基乙胺(6 mL,0.05 mol)和溴乙酸甲酯(3 mL,0.05 mol)，80 ℃反應12 h；冷卻，加入20 mL乙酸乙酯，抽濾去除固體，旋干濾液，得到黃色油狀物；加入少量甲醇，室溫攪拌4～6 h；抽濾，所得固體以甲醇重結晶，得到化合物Ⅳ。

1.2.5 2-[2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基-5-甲基苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(Ⅴ)的合成

控制溫度為5～10 ℃，于40～45 min內向DMF(20 mL)中緩慢滴加POCl3(2.4 mL)，室溫下攪拌所得POCl3/DMF混合物2 h，使之混合均勻；加入化合物Ⅳ(5.60 g,0.01 mol)的DMF(20 mL)溶液，75 ℃反應4 h；冷卻，倒入100 mL冰水中，抽濾所得固體粗品以體積比1∶1的乙酸乙酯-正己烷為洗脫劑進行柱分離，得到化合物Ⅴ。

1.2.6 2-[2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基-5-甲基苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(探針S13)的合成

將化合物Ⅴ(0.59 g,1 mmol)與鄰苯二胺(0.11 g,1 mmol)均勻混合于無水乙醇(10 mL)中， 80 ℃反應4 h；冷卻，旋干溶劑，得到固體粗品，以體積比1∶1的乙酸乙酯-正己烷為洗脫劑進行柱分離，得到探針S13。

1.3 探針T13的合成

研究探針的光譜性質時，需將乙酸甲酯型熒光探針S13水解為Cs鹽形式的熒光探針T13，使探針識別基團的多羧酸識別位點能夠快速識別目標物，給出即時熒光響應，同時，進一步提高探針水溶性。

分析天平準確稱取S13(C35H40N4O10)0.067 7 g(0.1 mmol)、CsOH·H2O 0.167 9 g(1 mmol)，加入10 mL無水乙醇，攪拌回流，反應過夜；待反應結束后，冷卻至室溫，真空旋干溶劑，得到探針T13。

1.4 探針T13對金屬離子的選擇性

選擇一價堿金屬(Na+)、二價堿土金屬(Mg2+、Ca2+、Ba2+)、過渡金屬(Fe3+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Ag+)及Sn2+、Al3+等13種常見金屬離子，進行探針T13對金屬離子選擇性考察實驗。取14支10 mL比色管，編號；1#為對照，僅加入探針T13；2#～14#分別加入Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Na+、Sn2+、Zn2+及Tris-HCl(pH值7.4)、探針T13，使T13與金屬離子的終濃度均為1×10-5mol·L-1。混合均勻，進行350～550 nm熒光光譜掃描，進一步分析各譜線在397 nm處的最大熒光強度，研究探針T13對金屬離子的選擇性。

1.5 探針T13的光譜性質

于一系列10 mL比色管中，分別加入探針T13溶液與濃度依次遞增的Zn2+/Cu2+/Hg2+溶液，使T13終濃度為10 μmol·L-1，Zn2+/Hg2+終濃度(μmol·L-1)分別為0、2、4、8、16、30、40、80、150、300、500、800、1 000，Cu2+終濃度(μmol·L-1)分別為0、2、4、8、16、30、40、80、150、300、500，混合均勻，進行350～550 nm熒光光譜掃描，通過分析熒光強度與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度的線性關系，研究探針T13的光譜性質。

保持探針T13與Zn2+的總濃度為10 μmol·L-1，于11支10 mL比色管中分別加入體積依次遞增的Zn2+溶液和體積依次遞減的探針T13溶液，使Zn2+的物質的量分數分別為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，通過分析熒光強度與Zn2+的物質的量分數的關系，得到探針T13與Zn2+的絡合比；進一步分析T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+體系397 nm處熒光強度峰值與金屬離子濃度的關系，確定探針T13與Zn2+/Cu2+/Hg2+的絡合比。

2 結果與討論

2.1 結構表征

化合物Ⅰ：淡黃色針狀結晶，產率90%，熔點32～34 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:7.66(s,1H,Ar-H),7.34(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),6.99(d,J=8.6 Hz,1H,Ar-H),4.36(t,J=3.0 Hz,2H,-CH2O-),3.76(t,J=3.2 Hz,2H,-CH2Cl),2.36(s,3H,-CH3);IR(KBr壓片),ν,cm-1:2 930.32(C-H),1 530.26(-NO2),1 357.37(-NO2),1 258.09(C-O-C),1 157.78(C-O),1 030.57(C-O),810.71(=C-H)。

化合物Ⅱ：黃色針狀結晶，產率93%，熔點148～150 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:7.79(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),7.64(s,1H,Ar-H),7.27(d,J=8.6 Hz,2H,Ar-H),7.03(s,1H,Ar-H),6.87(d,J=8.3 Hz,1H,Ar-H),4.50(s,4H,-OCH2CH2O-),2.44(s,3H,-CH3),2.36(s,3H,-CH3);IR(KBr壓片),ν,cm-1:2 930.87(C-H),1 602.88(C=C),1 521.12(-NO2),1 349.06(-NO2),1 253.53(C-O-C),1 172.98(C-O),1 057.85(C-O),814.56(=C-H)。

化合物Ⅲ：白色粉末，產率91%，熔點116～119 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:6.77(d,J=8.2 Hz,2H,Ar-H),6.71(s,1H,Ar-H),6.69(s,1H,Ar-H),6.65(d,J=8.6 Hz,2H,Ar-H),4.35(s,4H,-OCH2CH2O-),3.82(s,4H,2×-NH2),2.36(s,3H,-CH3),2.26(s,3H,-CH3);IR(KBr壓片),ν,cm-1:3 440.95(N-H),2 928.22(C-H),1 624.65(C=C),1 517.88(C=C),1 227.23(C-O),1 157.32(C-O),801.09(=C-H),674.64(=C-H)。

化合物Ⅳ：白色粉末，產率82%，熔點92～95 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:8.03(s,1H,Ar-H),6.81(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),6.76(s,1H,Ar-H),6.68(s,4H,Ar-H),4.37(s,4H,-OCH2CH2O-),4.15(s,4H,2×-CH2-),4.05(s,4H,2×-CH2-),3.57(s,12H,4×-CH3),2.33(s,3H,-CH3),2.26(s,3H,-CH3);IR(KBr壓片),ν,cm-1:2 953.88(C-H),1 751.26(C=O),1 518.92(C=C),1 255.06(C-O),1 170.72(C-O),795.78(=C-H),710.89(=C-H)。

化合物Ⅴ：淡黃色粉末，產率75%，熔點109～112 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:10.13(s,1H,-CHO),7.32(s,1H,Ar-H),6.79(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),6.69(s,1H,Ar-H),6.67(d,J=8.8 Hz,1H,Ar-H),6.45(s,1H,Ar-H),4.30～4.29(m,4H,-OCH2CH2O-),4.26～4.23(m,4H,2×-CH2COO-),4.15(s,4H,2×-CH2-),3.62(s,12H,4×-CH3),2.56(s,3H,-CH3),2.27(s,3H,-CH3);IR(KBr壓片),ν,cm-1:3 015.76(=C-H),2 952.21(C-H),2 923.21(C-H),1 749.40(OC=O),1 681.47(HC=O),1 601.23(C=C),1 520.54(C=C),1 257.98(C-O),1 201.54(C-O),1 167.63(C-O),711.38(=C-H);ESI-HRMS,m/z:611.221 5(calcd.for C29H36N2O11:588.231 4,[M+Na]+calcd.:611.221 1,[M+Na]+found:611.221 5)。

探針S13：白色固體，產率76%，熔點136～137 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:7.60(dd,J=5.9 Hz、3.1 Hz,2H,Ar-H),7.27(dd,J=6.6 Hz、3.7 Hz,3H,Ar-H),6.78(s,1H,Ar-H),6.71～6.64(m,3H,Ar-H),4.32(s,1H,-NH-),4.21(s,4H,2×-CH2-),4.08(s,4H,2×-CH2-),3.56(s,6H,2×-CH3),3.53(s,6H,2×-CH3),2.99(s,2H,-OCH2-),2.86(s,2H,-OCH2-),2.45(s,3H,-CH3),2.25(s,3H,-CH3);IR(KBr壓片),ν,cm-1:3 440.91(N-H),2 951.28(C-H),1 745.16(C=O),1 608.17(C=C),1 514.42(C=C),1 480.53(C=C),1 170.25(C-O),751.84(=C-H),710.97(=C-H);ESI-HRMS,m/z:677.281 0(calcd.for C35H40N4O10:676.273 9,[M+H]+calcd.:677.281 7,[M+H]+found:677.281 2)。

化合物Ⅰ～Ⅴ的1HNMR、IR數據均與預期結構相符，經合成引入的官能團羰基、醚鍵等均呈現其特征吸收，特征氫位移均能由1HNMR進行歸屬。探針S13的1HNMR、IR、MS數據符合預期設計，可以進行進一步的光譜性質分析。

2.2 光譜性質分析

2.2.1 探針S13的熒光激發與發射光譜

配制濃度為1×10-5mol·L-1的探針S13溶液，進行200～500 nm熒光光譜掃描，結果如圖2所示。

圖2 探針S13的熒光激發與發射光譜Fig.2 Fluorescence excitation and emission spectra of probe S13

從圖2可以看出，探針S13熒光激發與發射譜峰的鏡像對稱關系良好[9](λex=315 nm，λem=397 nm)，斯托克位移為82 nm。

2.2.2 探針T13對金屬離子的選擇性(圖3)

圖3 探針T13對金屬離子的選擇性Fig.3 Selectivity of probe T13 towards metal ion

從圖3可以看出，探針T13對Cu2+、Hg2+表現出猝滅型熒光響應，對Zn2+表現出增強型熒光響應，其它金屬離子未引起探針T13熒光強度的明顯變化。說明探針T13對Zn2+、Cu2+、Hg2+具有選擇性響應，能夠進一步用于水環境中Zn2+、Cu2+、Hg2+的選擇性識別與熒光標記。

2.2.3 探針T13與Zn2+/Cu2+/Hg2+的線性關系

T13-Zn2+、T13-Cu2+、T13-Hg2+溶液的熒光光譜如圖4所示。

圖4 T13-Zn2+、T13-Cu2+、T13-Hg2+溶液的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of T13-Zn2+,T13-Cu2+,and T13-Hg2+ solutions

從圖4可以看出，探針T13的熒光強度隨著Zn2+濃度的增加逐漸增強，隨著Cu2+/Hg2+濃度的增加逐漸減弱。

對T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+體系397 nm處熒光強度(y)與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度(x)進行線性相關性分析[10]，結果如圖5所示。

圖5 T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+體系熒光強度與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度的線性關系Fig.5 Linear relationships of fluorescence intensity of T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+ with concentration of Zn2+/Cu2+/Hg2+

從圖5可以看出，T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+體系熒光強度與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度的線性關系分別為：T13-Zn2+(0～8 μmol·L-1)，y=164.79x+1325(R2=0.9970)；T13-Cu2+(0～16 μmol·L-1)，y=-146.64x+5036.6(R2=0.9963)；T13-Hg2+(0～8 μmol·L-1)，y=-514.79x+6033(R2=0.9992)。表明，當Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度處于μmol·L-1數量級時，探針T13的熒光強度與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度之間具有良好的線性關系，能夠進行Zn2+/Cu2+/Hg2+的準確定量分析，初步滿足μmol·L-1數量級的生理濃度檢測要求。

2.2.4 探針T13與Zn2+/Cu2+/Hg2+的絡合比

T13-Zn2+溶液397 nm處熒光強度與Zn2+的物質的量分數之間的Job’s曲線如圖6所示。

圖6 T13-Zn2+溶液397 nm處熒光強度與Zn2+物質的量分數的Job’s曲線Fig.6 Job’s plot of fluorescence intensity at 397 nm of T13-Zn2+ solution with molar fraction of Zn2+

從圖6可以看出，對于T13-Zn2+的熒光增強型響應，當Zn2+的物質的量分數為50%時，T13-Zn2+溶液在397 nm處熒光強度出現最大值。表明，T13-Zn2+絡合物具有最大濃度，其定量結合比為1∶1。 為了進一步分析探針T13與Zn2+/Cu2+/Hg2+的絡合比，繪制T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+、T13-Hg2+溶液397 nm處熒光強度峰值與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度的關系曲線，結果如圖7所示。

圖7 T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+溶液397 nm處熒光強度峰值與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度的關系曲線Fig.7 Relationship between peak value of fluorescence intensity at 397 nm of T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+ solutions with concentration of Zn2+/Cu2+/Hg2+

從圖7可以看出，探針T13對Zn2+表現出特異性熒光增強響應，探針T13與Zn2+的定量結合比為1∶1，與圖6結論相似。探針T13對Cu2+、Hg2+表現出熒光猝滅響應，當Cu2+/Hg2+濃度較小時，探針T13的熒光不完全猝滅；當探針T13與Cu2+/Hg2+物質的量相同或Cu2+/Hg2+濃度較大時，熒光完全猝滅或熒光強度不再變化，表明探針T13與Cu2+/Hg2+的定量結合比為1∶1。

2.3 識別機制探究

離子識別實驗表明，探針T13對Zn2+表現特異性熒光增強響應，對Cu2+、Hg2+表現熒光猝滅響應；而S13、T13、T13-金屬離子的紫外吸收光譜(圖8)表明，T13、T13-金屬離子的紫外吸收光譜無明顯差別。

圖8 S13、T13、T13-金屬離子的紫外吸收光譜Fig.8 UV absorption spectra of S13,T13,and T13-metal ions

探針T13識別Zn2+、Cu2+、Hg2+的方式主要由兩方面因素決定：一方面，依據分子識別的ICT機制[11-12]，T13分子內同時具有電子給體和電子受體，且其分子結構中的熒光基團與識別基團直接相連。當識別基團與目標物Zn2+、Cu2+、Hg2+結合時，首先影響分子內的推-拉電子作用，進而誘使分子內電荷轉移過程隨之減弱或強化[13](圖9)，從而導致熒光光譜的變化。而當T13-金屬離子識別作用中的電荷轉移變化引起其熒光發射信號變化時，分子吸收則幾乎不受影響，反映為紫外吸收光譜幾乎無改變。另一方面，探針T13識別部分的氮原子具有孤對電子、表現給電子作用，而分子中的不飽和環則作為電子受體，分子內電荷轉移路徑發生于電子給體至電子受體，使探針分子呈現熒光。結合目標物Zn2+、Cu2+、Hg2+時，識別部分的氮原子、羧基氧原子提供孤對電子，金屬離子提供空軌道，形成弱的配位作用，從而減弱了氮原子的供電子能力，完全阻斷或部分削弱了ICT過程，導致T13-Cu2+/Hg2+體系熒光猝滅或強度減弱[14-15]，與T13對Cu2+、Hg2+的猝滅型識別作用相符合。此外，過渡金屬離子還可通過自旋-軌道耦合、電子或能量轉移使熒光基團熒光猝滅，導致熒光猝滅型響應。但由Irving-Williams規則可知，Zn2+呈現較弱的配位能力，其配位穩定性明顯弱于Cu2+、Hg2+，且極化能力與變形性較弱、空軌道較少。此外，Zn的還原性遠大于Cu和Hg，也導致Zn2+作為電子受體的能力較弱、較難接受氮原子孤對電子進行配位，致使T13-Zn2+體系呈現與T13-Cu2+/Hg2+相反的識別方式。探針結構中，識別基團結合目標物Zn2+、Cu2+、Hg2+的包合空腔[16-17]及可能識別機制如圖9所示。

圖9 探針T13對Zn2+/Cu2+/Hg2+的識別作用與ICT熒光響應機制Fig.9 Recognition of probe T13 for Zn2+/Cu2+/Hg2+ and fluorescence signaling based on ICT mechanism

3 結論

基于ICT機制定向構筑探針結構，進行水環境中探針-Zn2+/Cu2+/Hg2+的定性及定量識別性能分析，結果顯示，探針對Zn2+、Cu2+、Hg2+表現特征響應，熒光性能穩定、線性關系良好，探針與目標離子以1∶1定量結合，能夠進行水環境中Zn2+、Cu2+、Hg2+的定性檢測和定量分析，初步滿足μmol·L-1數量級的生理Zn2+、Cu2+、Hg2+濃度檢測。此外，結合熒光、紫外吸收等光譜學手段，初步闡明了探針對Zn2+、Cu2+、Hg2+的不同識別機制，對于未來工作中的探針結構優化、性能篩選與探針-目標離子的生物學成像研究提供了理論基礎。