EZH2抑制劑GSK343對腦膠質瘤細胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路及γδT細胞殺傷作用的影響

夏麗瓊， 楊明華， 謝 燕

(四川省綿陽市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科， 四川 綿陽 621000)

腦膠質瘤為臨床常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，常發(fā)生于神經(jīng)外胚層，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%左右[1]。由于腦膠質瘤生長迅速、侵襲性強、浸潤能力強，患者的生存率較低，行手術切除輔助放化療進行治療無法避免手術創(chuàng)傷大、易復發(fā)、預后不良等問題[2]。近年來，免疫療法在其他腫瘤治療中取得進展，抗腫瘤特異性強，不良反應輕微，有望成為手術后的最佳輔助治療方法。γδT細胞是具有特異性抗腫瘤活性的固有免疫T細胞，已應用于腫瘤的過繼性細胞免疫治療[3]。Zeste基因增強子人類同源物2(enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)是一種甲基化酶，可通過甲基化修飾抑制抑癌基因的表達，進而調節(jié)細胞增殖[4]。信號轉導與轉錄激活因子4(signal transducer and activator of transcription 4，STAT4)通路是重要的細胞因子信號轉導通路，磷酸化后可誘導免疫細胞產(chǎn)生干擾素-γ(interferon gamma，IFN-γ)，在腫瘤細胞的免疫治療中發(fā)揮重要作用[5]。GSK343是一種EZH2抑制劑，有研究顯示，GSK343在癌癥治療領域具有良好的前景及臨床價值[6]，但對腦膠質瘤及腫瘤免疫的作用鮮有研究。本研究將通過研究GSK343對腦膠質瘤U373細胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路及γδT細胞殺傷作用的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器：U373(人腦膠質瘤細胞系)(貨號：YS3679C)、胰蛋白酶(貨號：9002-07-7)，上海彩佑；DMEM培養(yǎng)液(貨號：ZY-P0032)，上海澤葉；胎牛血清(貨號：S9030)、EZH2抗體(貨號：Ezh2 Antibody)、p-STAT4抗體(貨號：bs-3430R-2)、IFN-γ抗體(貨號：BA3383-2)，上海恒斐；GSK343(貨號：S81294)，上海源葉；CCK-8試劑(貨號：QN1293-OIR)、AnnexinV-FITC/PI試劑盒(貨號：WE0325-THR)，北京百奧萊博；MODEL550酶標儀及ChemiDocXRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad；BD FACSCanto II流式細胞儀，美國BD。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組：取出在液氮罐中凍存的人腦膠質瘤U373細胞，37℃水浴復蘇，接種在DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化、傳代。U373細胞接種96孔培養(yǎng)板(1×105個/mL)，每孔100μL，設置分組為：對照組(細胞正常培養(yǎng)，不做藥物處理)和GSK343組(GSK343處理細胞)。

1.2.2CCK-8法檢測各組U373細胞增殖：將對照組、GSK343組(分別用10μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L和100μmoL/L GSK343處理細胞[7])U373細胞培養(yǎng)48h，加10μL CCK-8，37℃培養(yǎng)4h，酶標儀(450nm)測吸光度(optical density，OD)值，計算細胞增殖抑制率=(OD對照組-OD處理組)/OD對照組×100%[7]。

1.2.3流式細胞儀檢測U373細胞凋亡：U373細胞培養(yǎng)48h，收集、消化、洗滌并調整為1×106個/mL，分別加入Annexin V-FITC、PI各5μL，1h避光孵育，流式細胞儀檢測細胞凋亡率[7]。

1.2.4WB法檢測EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表達情況：將對照組、GSK343組U373細胞培養(yǎng)48h，收集、提取總蛋白、定量。電泳分離蛋白、轉PDVF膜、5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入一抗EZH2抗體(1∶500)、p-STAT4抗體(1∶500)、IFN-γ抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶500)，4℃過夜孵育，加羊抗兔二抗(1∶5000)，常溫孵育1h，發(fā)光法顯色，拍攝圖像，分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量為目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的條帶灰度值比值[7]。

1.2.5顯微鏡觀察U373細胞形態(tài)：在對照組、GSK343組基礎上按10∶1的效靶比加入100μL γδT細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)，孵育24h后，倒置顯微鏡觀察U373細胞形態(tài)。

1.2.6CCK-8法檢測γδT細胞對U373細胞的殺傷作用：在對照組、GSK343組基礎上按10∶1的效靶比加入100μL γδT細胞，同時分別設立相應的空白對照組、γδT細胞對照組和U373細胞對照組。孵育24h后，每孔加入CCK-8試劑20μL，繼續(xù)孵育4h后，在酶標儀450nm處檢測每孔OD值，計算殺傷活性。殺傷活性(%)=[1-(實驗組OD值-γδT細胞對照組OD值)/(U373細胞對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%[3]。

2 結 果

2.1GSK343對U373細胞增殖的影響：隨著GSK343的處理及處理濃度的升高，U373細胞增殖抑制率逐漸升高，U373細胞的GSK343半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentartion，IC50)處于20-50μmoL/L范圍內(nèi)，故選擇50μmoL/L作為GSK343組的最佳處理濃度進行后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 各組U373細胞增殖抑制率

2.2GSK343對U373細胞凋亡的影響：與對照組相比，GSK343組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測GSK343對U373細胞凋亡的影響

2.3GSK343對U373細胞中EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表達的影響：GSK343組EZH2蛋白水平較對照組顯著降低(P<0.05)，p-STAT4、IFN-γ蛋白水平較對照組顯著升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 WB檢測GSK343對U373細胞中EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表達的影響

2.4GSK343對γδT細胞殺傷的U373細胞形態(tài)的影響：與對照組相比，GSK343組有更多的U373細胞呈現(xiàn)不規(guī)則長梭形、胞質腫脹的細胞形態(tài)，見圖4。

圖4 顯微鏡觀察GSK343對γδT細胞殺傷的U373細胞形態(tài)的影響

2.5GSK343對U373細胞中γδT細胞殺傷作用的影響：各個時間點，與對照組相比，GSK343組γδT細胞對U373細胞的殺傷活性均顯著升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組γδT細胞對U373細胞的殺傷活性

3 討 論

腦膠質瘤是顱內(nèi)常見的腫瘤類型之一，起源于神經(jīng)膠質細胞，其組織類型包括星形細胞瘤、膠質母細胞瘤等。腦膠質瘤的發(fā)病率、惡性程度均較高，嚴重威脅人類生命。而目前外科手術切除等治療對腦膠質瘤患者生存率的改善作用并不顯著。近年來，發(fā)現(xiàn)免疫治療在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，正逐漸受到人們關注。γδT細胞是一群存在于外周血、具備天然免疫和適應性免疫雙重功能、可用于腫瘤免疫細胞治療的T細胞亞群，其T細胞抗原受體(T cell receptor，TCR)由γ、δ鏈組成。但由于腫瘤細胞表面表達的為γδ細胞，其所識別的分子常常丟失，導致免疫逃逸發(fā)生，限制了γδT細胞免疫治療腫瘤的效果[8]。因此，進一步研究影響腦膠質瘤細胞有關通路及γδT細胞殺傷作用的新靶點，可為腦膠質瘤防治提供參考。

EZH2是表觀遺傳調控基因，能夠對組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基催化從而抑制靶基因的表達。Ma等[9]研究表明，EZH2抑制劑可誘導腫瘤細胞凋亡，并有效降低其遷移能力。Yi等[10]研究表明，EZH2在卵巢癌中呈上調表達，通過介導TIMP2表觀遺傳沉默促進卵巢癌的遷移和侵襲能力，且使用EZH2抑制劑抑制EZH2表達可激活TIMP2轉錄進而影響卵巢癌的遷移、侵襲過程。丁沐陽等[11]研究表明，EZH2抑制劑GSK343對宮頸癌細胞的增殖與遷移能力具有明顯抑制作用。本研究結果顯示，隨著GSK343的處理及處理濃度的升高，U373細胞增殖抑制率逐漸升高，提示GSK343可呈濃度依賴性抑制腦膠質瘤細胞U373的增殖過程，并根據(jù)IC50將50μmoL/L GSK343作為處理U373細胞的最適濃度，并用于后續(xù)實驗中。后續(xù)實驗結果顯示，使用GSK343后，U373細胞OD值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，細胞中EZH2蛋白表達水平顯著降低，提示GSK343可抑制腦膠質瘤細胞中EZH2蛋白表達，抑制細胞增殖，并促進其凋亡，具有很好的腫瘤抑制作用，但具體作用途徑尚需進一步研究。

免疫是消滅腫瘤細胞的重要調控方式，涉及多種免疫細胞及復雜的通路調控。STAT蛋白家族是由多個相同結構域構成的胞內(nèi)蛋白質家族，激活后參與基因轉錄調控，在細胞發(fā)育、增殖和免疫防御中起重要作用[12]。STAT4是STAT蛋白家族成員之一，在子宮內(nèi)膜癌組織中表達升高，并與患者的病理分期、腫瘤分化、肌層浸潤、淋巴結轉移及3年預后生存有關。沈娟等[13]研究表明，IL-12通過促進STAT-4的磷酸化恢復自然殺傷細胞細胞的免疫功能。IFN-γ是目前Ⅱ型干擾素家族中發(fā)現(xiàn)的唯一成員，由T細胞產(chǎn)生，具有直接抑制腫瘤細胞增殖、抗腫瘤血管、增加腫瘤表面主要組織相容性復合體抗原和腫瘤壞死因子表達生成等多種抗腫瘤作用。IFN-γ可增強原發(fā)性、復發(fā)性和肺轉移骨肉瘤患者γδT細胞對骨肉瘤細胞的殺傷作用。本研究顯示，使用GSK343后，U373細胞中STAT4蛋白磷酸化、IFN-γ蛋白表達水平顯著升高，提示GSK343抑制腦膠質瘤細胞中EZH2蛋白表達后，可進一步促進STAT4磷酸化及IFN-γ蛋白表達，影響細胞增殖與凋亡。

近年來，γδT細胞在抗腫瘤免疫效應細胞中研究較多，體外擴增γδT細胞在腫瘤的臨床治療中療效較好。但腫瘤細胞為γδT細胞識別的表面分子丟失易造成免疫逃逸，發(fā)生免疫耐受，為了提高γδT細胞的臨床腫瘤治療療效，研究人員通過優(yōu)化治療方案，以期提高γδT細胞的殺傷活性。近年來研究顯示，GSK343在癌癥治療方面具有良好療效[14]，但其對腫瘤細胞中γδT細胞的殺傷作用的影響尚不完全明確。本研究結果顯示，使用GSK343后，U373細胞更易發(fā)生形態(tài)變化，各個時間點的γδT細胞對U373細胞的殺傷活性均顯著升高，提示GSK343有助于提高γδT細胞對U373細胞的殺傷活性，防止腫瘤免疫逃逸。趙珺等[15]研究顯示，托法替尼可通過抑制抗原刺激后人γδT細胞的活化及STAT4磷酸化、IFN-γ產(chǎn)生，從而抑制γδT細胞功能，治療自身免疫性疾病類風濕性關節(jié)炎。故推測GSK343可能通過調控EZH2，影響STAT4/IFN-γ通路，進而增強γδT細胞對U373細胞的殺傷作用，但具體作用機制還有待深入探究。

綜上所述，GSK343可通過下調EZH2表達及上調STAT4蛋白磷酸化、IFN-γ蛋白表達從而提高γδT細胞對腦膠質瘤U373細胞的殺傷作用，導致U373細胞增殖受到抑制，并誘導其凋亡，其對γδT細胞殺傷作用的提高可能有助于提高臨床免疫治療療效。但本研究為細胞體外培養(yǎng)實驗，在體內(nèi)的效果還需進一步驗證，GSK343影響U373細胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路與影響γδT細胞殺傷作用的內(nèi)在聯(lián)系還需深入研究。