miR-30a-5p靶向URGCP調控胃癌細胞凋亡和糖酵解的機制研究

楊 勐

(安徽省宿州市第一人民醫院消化內科， 安徽 宿州 234000)

胃癌(Gastric cancer,GC)作為一種非常常見的惡性腫瘤，目前在全球癌癥死亡中排名第二[1]。截止目前，手術作為GC的唯一治療手段仍被廣泛應用，但經根治性切除手術的GC患者有超過半數都會表現出局部復發或伴遠處轉移，已嚴重降低了患者的生存質量[2]。因此，有必要尋找新的GC治療靶點，以便更好地了解GC發生的分子機制從而開發出高效的靶向治療藥物。MicroRNAs(miRNAs)是一類內源性、非編碼的單鏈小分子RNA，主要通過介導下游基因在轉錄后水平的表達來參與調控包括腫瘤在內的多種生物學過程[3]。越來越多的研究表明miRNAs在GC發生發展的多個階段異常表達[4,5]。最近有研究報道[6]，miR-30a-5p可以在調控GC進展中作為腫瘤抑制因子存在，通過靶向下調YAP1的表達抑制GC細胞的增殖和侵襲。此外，細胞增殖調控基因4(Up-regulated gene 4/Up-regulator of cell proliferation,URG4/URGCP)作為促癌因子已被證實在包括GC在內的多種人類腫瘤中高表達[7]。本研究通過探討miR-30a-5p和URGCP在GC細胞中的表達差異及兩者對GC細胞凋亡和糖酵解的影響，旨在為GC的靶向治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及耗材:人正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)和GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)購買自上海生命科學研究院；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶和胎牛血清購買自美國Gibco公司；TRIzol試劑和LipofectamineTM3000轉染試劑購買自美國Invitrogen公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購買自上海碧云天生物科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒TaqMan Reverse Transcription kit和PCR熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit購買自日本Takara公司；miR-30a-5p mimic及其陰性對照miR-NC和URGCP過表達質粒(pcDNA-URGCP)及其空載質粒(pcDNA-NC)合成自上海漢恒生物公司； PCR引物合成自上海生物工程有限公司合成；其他常見分子生物學相關試劑與耗材購買自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及轉染:正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)和GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養。培養箱孵育條件設置為37度C，5%CO2和95%的相對濕度。待細胞融合度達到90%以上時進行傳代培養，取3代以后的對數期細胞用于后續實驗。對數期GC細胞按2×104個/孔的密度接種于6孔板中，按實驗要求將細胞分為Control組、miR-NC組、miR-30a-5p mimic組、pcDNA-NC組、pcDNA-URGCP組和pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic組，除Control組外，采用LipofectamineTM3000轉染試劑分別轉染miR-NC、miR-30a-5p mimic、pcDNA-NC、pcDNA-URGCP和pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic。轉染24h后，RT-PCR用于檢測轉染效率。

1.2.2CCK-8實驗檢測細胞增殖:將轉染后的各組HGC-27細胞按1×103個/孔的密度接種于96孔板中，分別孵育24h、48h、72h后再于每孔加入10μL的CCK-8試劑，繼續培養4h。采用自動酶標儀檢測各孔細胞在450nm波長處的吸光度值以反映各組細胞增殖能力。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡:將轉染后的各組HGC-27細胞按3×105個/孔的密度接種于6孔板中常規培養過夜。細胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化后經高速低溫離心，再懸浮在100μL的FITC結合緩沖液中。隨后，在避光條件下，加入5μL Annexin V/FITC和5μL PI與細胞混勻，室溫孵育30min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.4ELISA試劑盒檢測細胞ATP和乳酸水平:將轉染后的各組HGC-27細胞按1×106個/孔的密度接種于6孔板中常規孵育24h。嚴格按照ELISA試劑盒操作方法，通過ATP檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒檢測miR-30a-5p和URGCP對細胞內ATP和乳酸水平的影響。

1.2.5PCR檢測細胞相關mRNA表達:采用TRIzol試劑從轉染后的各組HGC-27細胞中提取總RNA。隨后，使用cDNA逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。根據制造商的說明，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit試劑盒在ABI 7500H檢測系統中實施PCR定量反應。PCR條件為：72℃預變性20min，95℃變性10min，60℃退火3min，共計45個循環。以GAPD或U6分別作為miR-30a-5p和URGCP的內參。數據采用2-ΔΔCq方法進行統計分析。PCR引物序列如下所示：miR-30a-5p引物序列，F:5′-TACGGATCCCCTTCATCTTACTTTTTTCCCCCAA-3′和R:5′-ATCGCTAGCGAAACTAGAAGCTCGGTGTGAATA-5′；URGCP引物序列，F:5′- GACCTTGCTGCCGACATTTAT-3′和R:5′-GCAGGAAACTGTCTGAGGAGAG-5′；GAPDH引物序列，F:5′-GCGGTGTCAAAGTGGAGAG-3′和R:5′-TGCTCGGTAGAAGGAGAAGATG-3′；U6引物序列，F:5′-AGTAAGCCCTTGCTGTCAGTG-3′和R:5′-CCTGGGTCTGATAATGCTGGG-5′。

1.2.6雙熒光酶素報告檢測miR-30a-5p和URGCP之間的靶向關系:設計合成URGCP的野生型(WT)和突變型(MUT)3'UTR，并將其克隆到psiCHECK-2熒光酶素表達載體中，以此得到URGCP-WT和URGCP-MUT熒光酶素報告載體。將miR-30a-5p mimic或miR-NC分別與URGCP-WT或URGCP-MUT通過LipofectamineTM3000試劑共轉染293T細胞。雙熒光素酶報告檢測系統用于檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.3統計學分析:數據以平均值±標準差表示。使用SPSS22.0軟件對數據進行統計分析。采用t檢驗或單因素方差分析來評估兩組或多組間的差異。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1各組GC細胞中的miR-30a-5p和URGCP mRNA表達水平:相比較正常胃黏膜上皮細胞GES-1，GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)中的miR-30a-5p表達水平均明顯下降(t=12.531,P<0.01;t=13.213,P<0.01;t=12.912,P<0.01)，見圖1A。此外，URGCP在GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)中的表達水平明顯高于GES-1組(t=11.124,P<0.01;t=10.214,P<0.01;t=12.141,P<0.01)。值得注意的是，miR-30a-5p在HGC-27細胞中的表達水平最高，而URGCP在HGC-27細胞中的表達水平最低，因此選擇差異性表達最大的HGC-27細胞用于后續實驗研究。見圖1B。

圖1 各組GC細胞中的miR-30a-5p和URGCPmRNA表達水平

2.2過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞增殖和凋亡的影響:相比較miR-NC組，轉染miR-30a-5p mimic的miR-30a-5p mimic組細胞中的miR-30a-5p表達明顯升高(F=134.142,P<0.01)。這一步驟代表了miR-30a-5p過表達質粒轉染成功，見圖2A。接下來，通過CCK-8實驗檢測過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞增殖能力的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞的增殖活性在72h時明顯降低(F=213.213,P<0.01)，提示過表達miR-30a-5p能抑制HGC-27細胞增殖，見圖2B。通過流式細胞儀檢測過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞凋亡能力的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞的凋亡水平明顯升高(F=421.243,P<0.01)，提示過表達miR-30a-5p能促進HGC-27細胞凋亡，見圖2C。

圖2 過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞增殖能力的影響

2.3過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞糖酵解功能的影響:通過ELISA試劑盒檢測過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞中ATP和乳酸產生的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞的ATP水平明顯降低(F=311.143,P<0.01)，同時乳酸水平也明顯降低(F=324.142,P<0.01)，提示過表達miR-30a-5p能抑制HGC-27細胞中ATP和乳酸的產生，從而抑制HGC-27細胞的糖酵解功能，見圖3。

圖3 過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞中ATP和乳酸產生的影響

2.4雙熒光酶素報告實驗檢測miR-30a-5p和URGCP之間的靶向關系:通過Starbase生物信息網站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)分析預測，miR-30a-5p與URGCP之間存在潛在的結合位點，見圖4A。雙熒光酶素報告實驗結果顯示，相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞中的URGCP-WT熒光酶素活性明顯降低(t=15.143,P<0.01)，而對miR-30a-5p mimic組細胞中的URGCP-MUT熒光酶素活性無明顯影響(t=1.873,P=0.172)，見圖4B。隨后，通過RT-PCR檢測過表達miR-30a-5p對URGCP表達的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組的URGCP表達明顯降低(F=431.139,P<0.01)，見圖4C。上述結果表明miR-30a-5p可以直接靶向集合URGCP并負調控URGCP在HGC-27細胞中的表達。

圖4 雙熒光酶素報告實驗檢測miR-30a-5p和URGCP之間的靶向關系

2.5共轉染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質粒對HGC-27細胞增殖和凋亡的影響:相比較pcDNA-NC組，pcDNA-URGCP組URGCP明顯升高(F=336.297,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組，pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic組URGCP明顯降低(F=451.192,P<0.01)，見圖5A。隨后，通過CCK-8實驗檢測共轉染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP對HGC-27細胞增殖能力的影響。相比較pcDNA組，pcDNA-URGCP組細胞增殖活性在72h時明顯升高(F=298.123,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組細胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP組細胞的增殖活性在72h時明顯降低(F=314.342,P<0.01)，預示了過表達URGCP能緩解miR-30a-5p mimic對HGC-27細胞增殖活性的抑制作用，見圖5B。通過流式細胞儀檢測共轉染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP對HGC-27細胞凋亡能力的影響。相比較pcDNA組，pcDNA-URGCP組細胞增凋亡水平明顯降低(F=441.194,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組細胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP組細胞的凋亡水平明顯升高(F=493.192,P<0.01)，預示了過表達URGCP能緩解miR-30a-5p mimic對HGC-27細胞凋亡水平的促進作用，見圖5C。

圖5 共轉染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質粒對HGC-27細胞增殖能力的影響

2.6共轉染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質粒對HGC-27細胞糖酵解功能的影響:最后，通過ELISA試劑盒檢測共轉染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP對HGC-27細胞中ATP和乳酸產生影響。相比較pcDNA組，pcDNA-URGCP組細胞的ATP和乳酸水平明顯升高(F=392.231,P<0.01；F=332.832,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組細胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP組細胞的ATP和乳酸水平明顯降低(F=413.141,P<0.01；F=392.194,P<0.01)，預示了過表達URGCP能緩解miR-30a-5p mimic對HGC-27細胞糖酵解功能的抑制作用，見圖6。

圖6 共轉染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質粒對HGC-27細胞中ATP和乳酸產生的影響

3 討 論

最近研究發現miR-30a-5p在GC中具有腫瘤抑制作用[6]。然而，miR-30a-5p調控GC發生發展的分子機制仍尚不清楚。本研究揭示了miR-30a-5p在GC中的表達模式及其對GC細胞生物學過程的調控。發現miR-30a-5p在GC細胞中的表達明顯降低。此外，下調miR-30a-5p表達能有效抑制GC細胞增殖和糖酵解，并促進細胞凋亡。此外，還揭示了miR-30a-5p可以負靶向調控URGCP。過表達URGCP能緩解miR-30a-5pmimic對GC細胞生長的抑制作用。

MiR-30a-5p作為一種被廣泛研究的非編碼RNAs已被報道在多種腫瘤中發揮作用[8,9]。例如，沉默miR-30a-5p基因可以通過靶向Septin-7和PRDM1基因來抑制膠質瘤細胞生長[10]。結腸癌中，過表達miR-30a-5p可以通過靶向DLT抑制癌細胞的增殖。目前miR-350-5p在GC中的研究局限于miR-30a-5p在GC中可以作為抑癌因子存在，抑制細胞增殖、遷移和侵襲緩解GC細胞生長。本研究顯示miR-30a-5p在GC細胞系中的表達明顯降低，提示其下調可能參與GC的發生發展。隨后，證實了miR-30a-5p過表達可以顯著抑制HGC-27細胞的增殖并誘導細胞凋亡，提示miR-30a-5p對GC有明顯的抑制作用。此外，研究首次證實了miR-30a-5p對GC細胞糖酵解功能的影響。研究表明大多數癌細胞即使在有氧氣的情況下也會優先利用糖酵解，而不是線粒體氧化磷酸化來獲取能量。這種能量代謝方式可以滿足包括GC細胞在內各種腫瘤細胞的快速增殖和惡性進展加劇。本研究結果首次證實在HGC-27細胞中過表達miR-30a-5p在抑制細胞增殖并誘導凋亡的同時，能顯著減少HGC-27細胞內ATP和乳酸的產生，這一結果表明了miR-30a-5p可以通過抑制GC細胞的糖代謝過程發揮抑癌作用。

由于miRNAs可以通過負調控其靶mRNA蛋白表達影響GC細胞的生長，本研究繼續探討了miR-30a-5p在GC中的可能靶點。生物信息學分析表明，URGCP是miR-30a-5p的潛在靶點。為了驗證這一預測，進行了熒光素酶報告分析。結果表明，miR-30a-5p與URGCP mRNA的3'UTR直接結合，提示URGCP是miR-30a-5p的直接靶點。進一步觀察后，HGC-27細胞中URGCP的表達是由miR-30a-5p在轉錄后水平負調控的。既往報道顯示，URGCP是一種細胞增殖上調因子，在多種腫瘤的生長過程中發揮著促進作用。在GC中也有研究報道，miR-671-5p通過靶向URGCP抑制GC細胞增殖，促進細胞凋亡，對胃癌具有保護作用。然而，關于URGCP在GC中的上游調控機制仍需要進一步探索。在本研究中，URGCP表達的上調明顯逆轉了miR-30a-5p過表達對HGC-27細胞增殖及糖酵解的抑制作用和細胞凋亡的促進作用，表明URGCP在miR-30a-5p介導的抑制GC細胞生長中起下游效應。

本研究證明了miR-30a-5p作為一種在GC中顯著下調的miR，可以通過直接靶向URGCP抑制GC細胞的增殖和糖酵解，并誘導細胞凋亡。這些結果進一步揭示了miR-30a-5p/URGCP軸在GC中的調控機制，提示了miR-30a-5p可以作為GC治療的潛在靶點。