人工藻結皮對河套平原鹽堿土理化性質和酶活性的影響

劉太坤, 高 班, 謝作明,2, 李 明, 毛 青, 趙欣鑫

(1.中國地質大學(武漢) 環境學院, 武漢 430078; 2.中國地質大學(武漢) 生物地質與環境地質國家重點實驗室, 武漢 430078)

人類活動加劇了土壤鹽堿化，造成耕地生產力下降，影響糧食生產及糧食安全。目前全球大約有8.31億hm2的土地受到鹽漬化的威脅[1]，次生鹽漬化土壤面積大約為7 700萬hm2，其中58%發生在灌溉農業區[2]。受鹽漬化影響的土壤分布在100多個國家，主要包括印度、巴基斯坦、中國、伊拉克、澳大利亞和美國。我國鹽漬化土壤總面積約9 913萬hm2，其中約30%具有可利用潛力[3]。鹽漬土中氮、碳和磷的含量通常較低，所含鹽堿成分具有較強滲透性和生理毒性，從而阻礙作物的生長，并削弱其產量[4]。

經過改良后的鹽漬化土壤可以轉變為重要的土地資源。生物改良方法是一種有效改善土壤理化特性，提高土壤利用效率的土壤改良技術。生物方式以重建土壤微生態為目的改良土壤環境條件，與物理和化學改良方式相比，具有成本低、生態友好等特點。

土壤藻是土壤微生物群落的重要組成部分。將具有活性的微藻作為生物肥料施加在土壤中可促進土壤養分循環[5]。土壤藻作為初級生產者，在土壤生態系統中發揮著重要作用。土壤藻的生長發育可以增加磷酸鹽的溶解度，促進礦物質釋放，持續提升土壤肥力，并有助于重建微生物群落[6-7]。在受干擾的土壤中接種土壤藻可恢復微生物群落，提高土壤有機質含量[8-9]。在含水率較低的鹽堿土中接種土著藻，能促進農作物的生長并提高作物產量[10]。土壤藻與土壤顆粒膠結形成的生物土壤結皮已被證明在鹽堿地、沙漠和石漠等惡劣生境中具有良好的抗逆性[11-12]。

本文利用鹽漬化農田土壤中篩選的土著藻和一株外源藍藻作為生物調節劑改良鹽漬化土壤，調查其對土壤基本理化性質、土壤養分、土壤酶活性等的影響，綜合分析土壤藻改良鹽漬化土壤的可行性。研究結果為鹽漬化土壤改良和土地資源可持續利用提供重要理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

試驗區設在河套平原地區杭錦后旗蠻會鎮永豐村七組(40°59′N，107°11′E)。河套平原海拔為1 007～1 050 m，土地面積約111.9萬hm2，灌溉面積約57.4萬hm2[13]，鹽漬化面積約43.1萬hm2[14]。地處中溫帶大陸性干旱、半干旱氣候區，降雨稀少，蒸發強烈，年均降水量135.9 mm，年均蒸發量1 984.3 mm，年日照時數平均4 449.6 h，年均氣溫8.7℃，無霜期126 d。地下水埋深一般0.5～1.5 m，地下水礦化度10～20 g/L，土壤類型以硫酸鹽為主，并伴有氯化物和碳酸鹽、重碳酸鹽。

試驗田耕作層土壤(0—20 cm)可溶性鹽含量為0.2%～1%，pH值為8～8.5，主要為輕中度鹽堿土，局部為重度鹽堿土。

1.2 土壤藻的篩選與培養

從試驗區鹽漬化土壤表層生物結皮中篩選并純化得到一株球狀土壤藻。用18S rRNA進行分子生物學鑒定，發現其屬于綠藻門(Chlorophyta)中的小球藻屬(Chlorella)，并命名為ChlorellaminiataHJ-01。土著絲狀混合藻也從生物結皮中分離，但并未純化，其中包含顫藻、鞘絲藻等土壤藍藻。小球藻C.miniataHJ-01和絲狀混合藻的培養基均為BG11。爪哇偽枝藻(Scytonemajavanicum(Kütz.) Born et Flah)是一種絲狀固氮藍藻，購自于中國科學院水生生物研究所，培養基為BG110。按照三級培養法，在室內(20 L透明塑料桶)和室外(培養池尺寸為4 m×2 m×0.5 m)中分別將藻種進行擴大培養。室內培養條件：光照強度4 000 lux，光暗比12 h∶12 h，溫度(24±2)℃，并通氣；室外以自然光通氣培養。

1.3 試驗地樣方設計

在試驗地共設置3個處理：樣地1(S1)只接種C.miniataHJ-01；樣地2(S2)按照10∶1的鮮重比例接種C.miniataHJ-01和S.javanicum；樣地3(S3)按照10∶1的鮮重比例接種C.miniataHJ-01和土著絲狀混合藻；空白對照組(CK)不接種藻液，噴灑等體積BG11培養基。每個處理設置3個重復樣地，每塊樣地15 m2。各樣地接種量均為5 g/m2鮮重，使用灑水壺(噴頭孔徑為3 mm)均勻接入地表。

接種后的30 d內，補充水分和營養元素以保證藻體成活。在第一周，每天9：00，13：00，17：00使用灑水壺向各樣地和對照組澆水，水量為4 L/m2。第二周以同樣的方式澆水，水量減為2 L/m2。第15—30天，每兩天以上述方式澆水，水量為2 L/m2。在第7天和第14天，用灑水壺向各樣地和對照組噴灑BG11培養基一次，用量為2 L/m2。接種30 d后停止補充水分和培養基，讓藻結皮利用空氣中的雨露自行生長發育。

1.4 土壤樣品的采集與前處理

試驗前和第45天后，分別在樣方內形成結皮和未形成結皮的區域按五點采樣法一式3份分層采集0—10 cm和10—20 cm土壤，用于土壤理化指標測定；采集0—5 cm深度土壤用于測定土壤酶活性。每5天用直徑2 cm的圓形塑料管采集土壤表層藻結皮，深度約為5 mm，用于測定人工藻結皮生物量。

土壤樣品在實驗室進行風干后，取50 g研磨并過2 mm篩，放入干燥的500 ml錐形瓶中，按照1∶5的土水比例加入250 ml無二氧化碳的水，加塞振蕩3 min，再用濾紙將土壤懸濁液重復過濾，直至土壤浸提液呈清亮為止。結皮樣品迅速風干后裝入自封袋密封，于4℃冰箱保存。

1.5 分析方法

葉綠素a采用乙醇提取法測定[15]。類胡蘿卜素和偽枝藻素利用丙酮提取法測定[16]。土壤含水率采用烘干法測定[17]。土壤pH值和電導率利用pH計和電導率儀測定。土壤有效氮和有效磷含量分別采用堿解-擴散法和碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定[18]。脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定；蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定；過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定；堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定[19]。室內風干后的藻結皮被切割成薄片，經過噴金前處理后，在場發射掃描電子顯微鏡(SU8010，HITACHI)下觀察其表面微觀結構，分析土壤藻結皮的形態和膠結機理。

1.6 數據處理

所有數據采用3次重復的平均值±標準偏差來表示。使用OriginPro 2021進行圖形繪制。使用SPSS Statistics 26進行單因素方差(One-way ANOVA)和顯著性分析，p<0.05表示顯著。

2 結果與分析

2.1 人工藻結皮的發育和微觀結構

葉綠素是藻類光合作用的主要捕光色素，定量分析葉綠素含量對于光合作用、初級生產力及相關研究具有重要意義。如圖1所示，在前30 d，由于人工補充水分和培養基，制造了適宜的外部環境，藻結皮的生長速度較快，且達到一定的生物量。第30天后藻結皮大量增殖，至第35天生長開始趨緩，第40天后呈現穩定停滯狀態。樣地S2的藻結皮生長最佳，在第45天葉綠素a含量達到20.36 μg/g。樣地S3和樣地S1生長情況相對較差，最高分別達到15.12，11.37 μg/g，分別占樣地S2的74%，56%；對照組樣地在自然狀態下形成了少量結皮，但在第45天藻結皮的葉綠素a含量僅為2.53 μg/g。

圖1 人工藻結皮的生物量

樣地S2接種有S.javanicum，其分泌的偽枝藻素作為一種保護色素，可有效抵御紫外輻射對人工藻結皮的損傷[20]，因此該混合藻結皮既能耐受一定鹽堿脅迫，也能耐受紫外輻射，因而快速生長。在樣地S3中接種的混合絲狀藻，其抵抗紫外輻射的能力相對較弱，導致其生長相對較慢。而樣地S1，只接種了C.miniata，其接種土壤藻太過單一，對環境的抵抗能力較弱，土壤藻生長更慢。空白對照組樣地因為沒有接種任何藻液，只補充了水分和培養基，所以土壤藻生物量極低。

圖2顯示了人工藻結皮中類胡蘿卜素和偽枝藻素含量在試驗前后的變化。在第45天，樣地中兩種色素的含量由高到低均為S2>S3>S1>CK，與結皮中葉綠素a的含量變化規律一致，表明藻結皮分泌類胡蘿卜素和偽枝藻素的能力與生物量呈正相關。

土壤藻接種1 d后，由于藻結皮還未形成，樣地S1，S2和S3的表層土壤類胡蘿卜素含量均較低，分別為1.01，1.96，2.31 μg/g。經過45 d的培育，樣地S1，S2和S3藻結皮中類活蘿卜素含量分別為1.47，5.59，3.34 μg/g。樣地S2藻結皮中類活蘿卜素含量顯著增加(p<0.05)，增幅為185%。其次為樣地S1增加46%和樣地S3增加45%(p>0.05)。在未接種的空白對照組中，雖然形成了一定厚度的藻結皮，但其中類胡蘿卜素含量依然很低，未超過0.5 μg/g，變化并不顯著(p>0.05)。3個樣地類胡蘿卜素含量的差異主要來自接種藻液的不同。

藻結皮中偽枝藻素含量變化與類胡蘿卜素相似。由于接種了S.javanicum，經過45 d的生長后，樣地S2土壤表層中偽枝藻素含量的變化最為顯著(p<0.05)，增加了144%，達到24.45 μg/g，為樣地中最高值。樣地S3土壤表層中偽枝藻素含量的變化較顯著(p<0.05)，即接種的少量混合絲狀藻同樣產生了少量的偽枝藻素。而樣地S1藻結皮中的偽枝藻素含量僅增加12%，變化不顯著(p>0.05)。對照組中雖然有少量土壤藻生長，但45 d后，其中偽枝藻素的含量僅為0.25 μg/g(p>0.05)。

圖2 人工藻結皮中類胡蘿卜素和偽枝藻素含量的變化

在藻結皮的人工培植過程中，除了考慮高鹽堿環境外，還有必要提高結皮整體的抗干旱和抗紫外輻射能力。類胡蘿卜素是一種光合系統保護色素，當環境光照變得較為強烈時，藻細胞產生類胡蘿卜素減少活性氧的損害。S.javanicum是一種具有固氮作用的藍藻，能在干旱和半干旱等特殊環境中生存。謝作明等[11]研究發現，土壤藻為了應對惡劣的環境條件，產生偽枝藻素等保護色素和MAAs(三苯甲咪唑氨基酸)的能力顯著增強。

圖3A為人工藻結皮截面的微觀結構，可見土壤藻的藻絲在土壤礦物質中間穿插生長，與土壤顆粒相互纏繞結合，從而定植在土壤表層。圖3B為人工藻結皮表面的微觀形態。可見大量土壤藻藻絲相互纏繞形成“微生物墊”覆蓋在土壤表層，在藻結皮表面還有單細胞土壤藻。

圖3 人工藻結皮的微觀結構

結皮的膠結機理可以大致分為兩類。一是藻絲的機械性束縛作用，使其與土壤顆粒緊密捆綁和纏繞，這種機械纏縛力成為細粒聚合的主要控制力，將分散的土壤聚集起來[21]；二是藻體分泌的胞外物質含有大量糖類，具有較強的黏性，能將藻體和土壤顆粒牢牢地粘黏住，起到“膠水”的作用。土壤顆粒與藻體膠結形成的大量團聚體覆蓋在土壤表層，不僅能抵御風力對土壤的侵蝕，而且還能減少土壤水分的蒸發，從而降低土壤中鹽堿成分向上遷移而在表層積聚，達到控制耕作層土壤鹽堿含量的目的。

2.2 人工藻結皮對土壤理化性質和養分的影響

圖4為各樣地土壤含水率的變化情況。接種藻液前，試驗地植被稀少，水分蒸發量大，各樣地0—10 cm土壤的含水率(平均值為14.4%)普遍低于10—20 cm深度的土壤含水率(平均值為16.5%)。

對照組樣地土壤含水率顯著下降(p<0.05)，在結皮區和無結皮區0—10 cm土壤的含水率分別減少31.2%，42.7%。結皮區和無結皮區10—20 cm土壤的含水率下降同樣顯著(p<0.05)，降幅分別為42.0%，47.7%。3個處理組樣地土壤含水率在兩個深度也有較明顯的下降(p<0.05)，但降幅相對對照組偏小。

在試驗前，當地有過較大的降雨，導致土壤初始含水率較高。在整個試驗期間，氣候干旱，降水極少，蒸發量很大。因此0—20 cm土壤的含水率總體呈減少趨勢，表明人工藻結皮并未完全阻止土壤水分的蒸發。但是，與裸露土壤相比，形成藻結皮的區域，其土壤含水率相對較高，說明土壤藻結皮一定程度上能適當緩解水分的損失，從而達到一定保水效果。土壤藻的拓殖作用能夠改善土質，使土壤中粗砂粒含量降低，細顆粒物增加[22]，從而增強土壤對水分的調蓄能力。保持淺層土壤中有效水分的含量，也間接地影響了植被及微生物的分布。

圖4 人工藻結皮對土壤含水率的影響

如圖5A—B所示，在0—10 cm土壤中，樣地S1，S2，S3結皮區域的土壤pH值均小幅下降，且低于對應的無結皮區域土壤，其中樣地S1最明顯(p<0.05)。而對照組結皮區土壤的pH值略微升高，無結皮區域則顯著升高(p<0.05)。總體來看，10—20 cm土壤略高于上層土壤，但變化規律相似。在試驗期內，樣地S2，S3中0—20 cm土壤pH值變化并不顯著(p>0.05)。

由圖5C—D可知，人工藻結皮可降低0—10 cm土壤的電導率，樣地S1土壤電導率顯著下降57%(p<0.05)，樣地S2，S3分別下降21%，13%。而在未形成結皮的區域，鹽分在地表大量積累，土壤電導率均高于初始值。在對照組中，所有區域土壤電導率均升高。人工藻結皮對10—20 cm土壤的電導率的影響不顯著(p>0.05)。僅樣地S1中結皮區土壤的電導率小幅下降了0.13 mS/cm，其余區域均有所增加。

圖5 人工藻結皮對土壤pH值和電導率的影響

試驗田植被覆蓋度低，加之氣候干旱，水分蒸發量大，攜帶鹽分的地下水沿土壤孔隙大量上移，導致鹽分不斷累積在土壤表層，因此，在試驗前0—10 cm土壤的電導率普遍高于10—20 cm土壤的電導率。由于人工藻結皮的存在，延緩了土壤水分的蒸發，阻止了大量鹽分伴隨著孔隙水向上運移，導致0—10 cm土壤鹽分下降，土壤電導率下降明顯。

從圖6可以看出，樣地S1，S2，S3的0—10 cm土壤中有效氮和有效磷的含量隨著土壤藻結皮的發育有小幅增加，其中樣地S2土壤中的有效氮變化最顯著(p<0.05)，含量達到90 mg/kg，這是由于接種的S.javanicum具有固氮作用，將大氣中的N2轉化為氮素，輸入到了土壤中。而對照組中土壤的有效氮和有效磷含量變化不顯著(p>0.05)。

圖6 人工藻結皮對土壤有效氮和有效磷的影響

在土壤生態系統中，土壤藻是初級生產者的組成部分。藻細胞葉綠體通過光合作用，將大氣中CO2轉化為碳水化合物。部分土壤藍藻，如S.javanicum，在固氮酶的催化作用下，將大氣中不易被生物直接利用的N2還原為可被生物直接利用的化合態氮，從而增加土壤中的氮素含量，提高土壤肥力，為后續植物的生長補充營養。藍藻的應用不僅提供氮，而且通過胞外磷酸酶和有機酸的排泄在無機磷酸鹽的轉化中發揮重要作用[23]，并可提高磷對植物的生物利用度。一些藻類能夠溶解土壤和沉積物中不溶性的Ca3(PO4)2，FePO4，AlPO4和羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH][24]。據報道，藍藻生物體是C，P，N，Mg，Ca，Na和K的不穩定存儲庫，這些元素會由于藻類生物體的死亡和快速礦化而釋放到土壤中[25]。

2.3 人工藻結皮對土壤酶活性的影響

表1為人工藻結皮培植45 d后，不同樣地表層土壤中脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶的活性。與對照組相比，各樣地中酶活性均有不同程度的增加。3種處理的表層土壤脲酶活性分別提高了9.9%，14.1%，52.1%，蔗糖酶活性分別提高了14.8%，17.3%，20.7%，過氧化氫酶活性分別提高了16.7%，9.6%，11.2%，堿性磷酸酶活性分別提高了6.8%，41.7%，15.1%。

表1 人工藻結皮對土壤酶活性的影響

土壤酶是土壤中各種酶類的總稱，土壤中各種生化反應都由其催化。土壤酶來源于土壤微生物和動、植物活體或殘體，土壤酶活性指示土壤肥力和生產力水平的高低[26]。脲酶能夠促進土壤中有機氮的轉化，酶促作用產物——氨是植物氮素營養源之一[27]，因此可以用脲酶的活性來反映土壤中氮素狀況。相對于對照組，人工藻結皮能顯著提高土壤表層的脲酶活性，其中樣地S3效果顯著好于其他樣地(p<0.05)。蔗糖酶的功能是把高分子化合物分解成可被植物和微生物利用的營養物質，促進土壤微生物的進一步生長和發育，加速土壤的熟化和增加土壤肥力[28]。無論是單一藻結皮還是混合藻結皮，均能不同程度顯著提高土壤表層蔗糖酶活性(p<0.05)。過氧化氫酶與土壤有機質的轉化速度有密切關系。土壤藻結皮向土壤輸入有機質，使得過氧化氫酶活性提高，接種C.miniata顯著提高土壤表層過氧化氫酶活性(p<0.05)。堿性磷酸酶活性反映土壤有機磷轉化狀況，其酶促作用產物——有效磷是植物磷素營養源之一[18]。土壤磷酸酶活性增強表明土壤中磷酸鹽和有效磷之間的溶解和固定轉化加強，有更多的有機磷在磷酸酶的作用下轉化為有效磷，從而加速土壤生物從土壤中吸收磷素。混合接種C.miniata和S.javanicum的樣地比其他樣地的效果更顯著(p<0.05)。

土壤藻結皮能夠改善表層土壤的理化性質，為土壤微生物生長提供適宜的環境條件。與下層土壤中微生物相比，表層土壤中的微生物更易于利用藻結皮中的養分供其生長。在本研究中，土壤藻結皮能夠提高鹽堿地表層土壤酶活性和土壤肥力。

3 結 論

藻體與土壤顆粒膠結狀態的微觀結構顯示出土壤藻在應對鹽堿脅迫和改善土壤結構穩定性方面具有優良性能。具有耐高鹽堿脅迫的土著小球藻、絲狀混合藻和外源藍藻培植成的人工藻結皮，可延緩土壤表層水分的蒸發，阻止土壤中的鹽分隨孔隙水向上運移而在地表累積，并有效改善土壤pH值和電導率。人工藻結皮增加了土壤中有效氮和有效磷的含量及土壤酶活性，提高土壤養分含量。因此，人工藻結皮可以減少鹽堿物質在耕作層土壤中的積聚，并有效改良鹽漬化農田土壤，促進農業的可持續發展。