干熱河谷土壤酶活性和車軸草生長對氮磷添加的響應

李 歡, 魏雅麗, 閆幫國, 孫 毅, 和潤蓮, 李義林, 方海東

(1.四川農業大學 資源學院, 成都 611130; 2.云南省農業科學院 熱區生態農業研究所, 云南 元謀 651300)

氮(N)、磷(P)作為主要養分元素，對維持地球生物化學循環，保證生態系統物質循環和能量流動有重要作用，同時N，P也是自然陸地生態系統中的主要限制性元素[1-2]。然而由于化石燃料燃燒所產生的N沉降[3-4]，導致土壤中的N含量顯著提高，改變了土壤中原有的養分限制模式，主要觀點認為它緩解了原有的N限制，轉變成P限制，另一些觀點認為土壤養分限制模式轉變為N，P共同限制[5-6]。土壤酶直接參與土壤生態系統中C，N，P的循環，如參與土壤碳轉化的β-D-葡糖苷酶(BG)，參與土壤氮轉化的β-1,4-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NAG)和脲酶(URE)，以及參與土壤磷轉化的磷酸酶(AP)等[7]。這些酶對環境因子敏感，可作為評價土壤質量和養分供應能力的重要指標[8-9]。

土壤酶本身作為一種蛋白質，其合成過程對氮的需求較大[10]，因此氮的豐缺對土壤酶活性也具有重要的調控作用。勒佳佳等[11]對天山高寒草原土壤酶活性研究發現氮添加顯著增加BG和β-1,4木糖苷酶活性，而李歡等[12]發現干熱河谷土壤BG，NAG，URE和AP酶活性與土壤C有關。樊博等[13]研究干熱河谷土壤酶活性對碳氮添加的響應發現，碳氮交互作用顯著影響了干熱河谷土壤的AP，BG和亮氨酸胺肽酶活性。曾泉鑫等[14]研究氮添加對毛竹林土壤微生物碳磷限制時發現，氮添加顯著降低了NAG活性和N∶P酶活性比，提高了AP酶活性和C∶N酶活性比，加劇了微生物C，P限制。Marklein等[15]研究發現氮添加能夠提高磷酸酶活性，從促進磷循環速率。當養分限制發生變化時(如，從N限制到P限制)，微生物可能會調整相關酶的生產(如增加磷酸酶的活性)，以平衡營養需求(微生物需求)和供應(周圍環境)之間的營養平衡[16-17]。

植物同樣受到氮磷養分的限制[1-2]，但是不同的土壤中植物受到氮磷限制的程度不同。事實上，植物因不同土壤而異，分別會受到氮限制、磷限制或者氮磷共限制[18]。土地利用對不同土壤上植物生長限制養分的影響還缺乏充分研究。植物與土壤酶活性對養分添加是否具有相同的響應特征還存在很大的不確定性。

元謀干熱河谷是西南橫斷山區中的生態脆弱區，通過土壤養分管理促進植被恢復，對改善該區生態環境具有重要意義。本研究通過在不同土地利用類型土壤中設置不同的養分添加處理，以車軸草(TrifoliumrepensL.)作為模式植物，比較分析不同土地利用類型植物生長狀況和酶的活性對氮磷添加的響應，探討不同土地利用類型下植物生長的限制養分和養分對土壤酶活性的調控作用，并揭示植物生長與土壤酶活性在養分處理下的相互關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

元謀縣干熱河谷區內(101°35′—102°06′E，25°23′—26°06′N)水熱矛盾突出，海拔差異大，氣候呈垂直氣候帶狀分布，年均降水量約680 mm，年均蒸發量約3 215 mm，干燥度(蒸發量/降水量)達4.5以上。隨海拔升高，植被群落類型由稀樹草原向灌木林和常綠闊葉林過渡。本研究在野外采集元謀縣6種典型土地利用類型土壤，即灌木林地、草地、有林地、旱地、水澆地和侵蝕裸地，其土壤類型均為燥紅土。每種利用類型有5個重復采樣點，其中每個采樣點再選取10個點采集混合樣，運到云南省農業科學院熱區生態農業研究所實驗室內進行土壤性質分析，部分土壤置于溫室大棚內進行盆栽試驗。

1.2 試驗設計

本試驗選擇車軸草(TrifoliumrepensL.)作為測試植物。車軸草是一種常見的多年生豆科草本植物，是土壤功能恢復中常用的修復植物之一[19-20]。車軸草在元謀當地野外沒有分布，在當地土壤中沒有特異病原體，因此不會干擾養分對植物生長的作用。試驗因子設計包括6種土地利用類型，5種養分處理，每個處理重復5次(6種土地利用類型×5個處理×5種重復=150盆)。除去粗糙根和石頭，土壤樣品自然風干過2 mm篩并充分混合后，取一部分土樣測定土壤養分性質(表1)，另一部分鮮土等量裝入花盆中(上直徑10 cm×下直徑7 cm×高度13 cm)約1 kg。將花盆分成5份，做5個處理，分別為：(1) 對照。不添加氮磷(CK)；(2) 添加氮(N)(硝酸銨，0.078 5 g N/盆，相當于每1 hm2加100 kg N )；(3) 添加磷(P)(磷酸二氫鉀，0.039 2 g P/盆，相當于每1 hm2添加50 kg P的標準)；(4) 添加氮磷(NP)(硝酸銨+磷酸二氫鉀，0.078 5 g N/盆+0.039 2 g P/盆)；(5) 添加有機質(OM)(幾丁質+植酸鉀，0.078 5 g N/盆+0.039 2 g P/盆)。每盆放15～20粒車軸草種子，萌發后，每盆只留10株植物苗，盆栽試驗期間，每天澆水2次(約12.4 mm)。4個月后收獲植物并采集土壤，土壤鮮土混勻并過2 mm篩放置在4℃冰箱中保存，測定土壤酶活性。

表1 土壤養分及其化學計量學特征

1.3 測試項目與方法

1.3.1 土壤性質測定 pH值采用酸度計測定(土∶水=1 g∶2.5 ml)；總氮(TN)、總碳(TC)采用元素分析儀測定；全磷(TP)采用鉬銻抗比色法；鈣(Ca)、鉀(K)、硼(B)、鎂(Mg)、錳(Mn)等全量元素采用電感耦合等離子體發射光譜法(ICP)測定；銨態氮、硝態氮采用2 mol/LKCL溶液提取，分別采用水楊酸法[21]和采用氯化釩法[22]；有效磷(Olsen-P)采用孔雀石綠測定法。

1.3.2 土壤酶活性測定 土壤酶活性測定采用熒光底物試驗方法[23]，其中測定β-D-葡糖苷酶(BG)、酸性磷酸酶(AP)、β-1、4-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NAG)采用pH值為5.0的50 mmol/L醋酸緩沖液[24]。在微孔板中加入50 μl 4-甲基傘形酮(MUB)為標準物，另一部分孔中加入50 μl底物，分別為4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷(BG)，4-甲基傘形酮酰磷酸酯(AP)，4-甲基香豆素-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(NAG)。在標準物和底物基礎上加入150 μl土壤懸液，并在標準物和底物孔中設置無土壤的對照[25]。所有酶測定時均放在恒溫搖床在120 r/min下培養3 h，溫度為25℃。然后放入Spark 20 M全波長掃描式多功能讀數儀測定，測定時由儀器加樣器加入10 μl mol/L NaOH到微孔板中。激發光設置為365 nm，發射光為450 nm。脲酶(URE)測定時，加入pH值為5.0的醋酸緩沖液，并加入尿素底物，至25℃恒溫培養箱培養12 h后，加入60 μl水楊酸溶液和60 μl次氯酸鈉溶液，反應50 min后，用650 nm波長測定吸光率，標準曲線采用銨態氮溶液測定[26]。

1.3.3 植物生物量測定 植物生物量通過70℃連續烘干植物樣品至恒重稱重得出。

1.4 統計分析

使用SPSS 22.0對土地利用類型和養分添加進行多因素方差分析法(ANOVA)分析；對植物生物量和土壤酶活性的影響采用LSD多重比較方法；對土壤酶活性與植物生物量的相關性采用回歸分析法分析。

2 結果與分析

2.1 植物生物量對氮磷添加的響應特征分析

植物生物量對P添加具有顯著響應，灌叢、草地、森林和裸地這4種土地利用類型的P或N+P添加處理的植物生物量顯著大于CK和N添加處理(圖1)。且灌叢、草地、森林土壤NP添加處理下的植物生物量顯著高于單施P肥處理。結果顯示灌叢、草地、森林、新農和裸地的+P處理生物量比CK分別增加了724.14%，782.93%，1 022.50%，37.38%，505.17%，而常農+P處理生物量比CK減少了25.73%。

注：CK表示對照；N表示N添加；P表示P添加；NP表示N，P同時添加；OM表示有機態氮磷添加。圖中不同字母表示相同土地利用類型下養分處理的差異顯著(p<0.05)，下圖同。

然而，新農和常農的植物生物量在N，P添加處理下差異不顯著，新農在P添加處理下植物生物量最大，比CK處理增加了37.38%；常農在NP添加處理下植物生物量最大，比CK處理增加了33.86%，在P添加處理下植物生物量最小，比CK處理降低了25.73%。由表2可知，植物生物量受到土地利用類型和養分添加處理顯著影響，其中養分添加處理是最重要因素。

表2 土地類型與養分添加處理間的雙因素方差分析(F值)

2.2 土壤酶活性對氮磷添加的響應特征分析

土地利用類型顯著影響土壤酶活性，而養分添加處理對各土壤酶活性均無顯著影響(表2)。灌叢土壤AP，BG酶活性中最高，顯著大于其他類型的土壤，NAG活性在灌叢和草地土壤中最高，顯著大于其他類型，而URE酶活性在常年耕作農田中最高，這4種土壤酶活性均在裸地土壤中最低。不同土地利用類型下，AP，BG，NAG這3種土壤酶活性大致呈灌叢>草地>森林>新農>常農>裸地變化趨勢，灌叢的AP，BG，NAG比分別是裸地的9，26，16倍；URE土壤酶活性大致呈常農>新農>草地>森林>灌叢>裸地，常農的URE是裸地的7倍(圖2)。

圖2 不同土地利用類型和養分處理下的土壤酶活性

2.3 植物生物量、土壤酶活性與養分的相關性分析

結合植物生物量、土壤酶活性和土壤養分背景值相關指標進行相關性分析(表3)發現，植物生物量僅與土壤有效養分(銨態氮、有效磷)相關，與土壤酶活性、全量養分和硝態氮不相關；除URE酶外，其余土壤酶均與土壤TC，TN含量顯著相關，且相互間呈顯著相關關系；URE酶僅與有效養分(銨態氮、有效磷)相關。

3 討 論

本研究發現植物生物量對P添加響應強烈，且在P和NP養分添加條件下灌叢、草地、森林和裸地的植物生物量顯著高于CK和N養分添加處理，整體上看NP同時添加的植物生物量顯著高于單施P肥處理。這可能是因為N，P同時添加，可以產生協同效應，刺激植物生長，促進P的吸收，這與盧廣超[27]、范愛連[28]、Bucci[29]等研究一致。且通過雙因素方差分析(表2)和相關性分析(表3)發現，植物生物僅與有效養分(硝態氮、有效磷)相關，由此可見氮磷含量是影響植物生物量變化最關鍵因素。進一步分析可以發現植物生長可能為序列限制(首先受到P限制，當P限制緩解后開始出現N限制，造成N，P共同添加效果大于單獨的P添加)。研究區干熱河谷屬于熱帶亞熱帶區域，前人研究發現越來越多的P限制出現在具有高度風化土壤的熱帶和溫帶森林中[30-31]，與本研究結果一致。因此，P限制是影響干熱河谷地區植被生長的主要因素之一。P添加能夠緩解P限制產生的影響，但會將植物生長所受的限制進一步轉變為N限制或N，P共同限制，這與鄭斯元[32]的研究一致。此外，本研究發現侵蝕裸地添加有機質的植物生物量最高，說明有機質可有效促進裸地的植物生長，這可能與裸地土壤中有機質嚴重缺乏有關。值得注意的是，本研究中采用一種豆科植物作為研究對象，其養分限制模式可能與非豆科植物不同。但是本研究中發現除了極少個例外，車軸草根系并未形成根瘤，可能與土壤中缺少對應的根瘤菌有關，因此，可以排除固氮對車軸草N，P限制的影響。

表3 植物生物量、土壤酶活性與土壤化學性質的相關性

本研究中土壤酶活性受土地利用類型的顯著影響(圖2)，但各養分處理間差異不顯著。土壤酶參與土壤的各種生化反應，其活性體現了反應的強度和轉化情況[33]。土壤中的各種物質轉化主要由磷酸酶、脲酶、水解酶等參與的酶促反應產生，可以有效反映土壤C，N，P養分之間的變化特征。基于資源配置理論，在添加N，P處理下，微生物生長和酶合成過程中的限制養分得以緩解，從而促進土壤酶活性增加[34]。然而這里并未發現氮磷對土壤酶活性的促進作用，表明其他因素可能限制了土壤酶活性。本研究發現同時BG，NAG和AP活性與土壤背景C含量之間具有高度相關性，說明C含量可能是限制酶活性變化的重要影響因子。同時本研究發現土壤酶活性與植物生物量不存在明顯相關關系(表3)。尤為明顯的是，裸地土壤中添加P，N+P和OM時植物生物量顯著提高(圖1)，但土壤酶活性仍處于較低水平，與CK無顯著差異(圖2)，這可能與土壤酶活性和植物生長的調控養分不一致有關。

4 結 論

元謀干熱河谷土壤類型和氮磷養分都會對植物生物量產生影響，土壤氮磷養分是最關鍵因素。灌叢、草地、森林和裸地的植物生長受P限制，而農田土壤(新農和常農)的養分限制不明顯。同時添加N，P比單施P肥對植物生長的促進作用更明顯。而土壤酶活性變化與土地利用類型相關，灌叢草地的BG，NAG和AP活性較高，而農田的URE活性較高。土壤酶活性與土壤C含量緊密相關，不受氮磷添加的影響，與植物生長之間沒有明顯的關聯特征。土壤酶活性不能作為指示土壤支撐植物生長的指標。