非洲豬瘟病毒結構蛋白p54的優化表達及間接ELISA抗體檢測方法的建立

張皓淳

(遼寧省農業發展服務中心，遼寧 沈陽 110034)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是因為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)所導致的家豬、野豬等相關動物品種所產生的一類熱性、高度接觸性的出血性傳染病，臨床主要以高熱、淋巴結及臟器嚴重出血作為特征，具有較高的接觸傳染性，不同品種和年齡段的豬均可感染，發病率和死亡率較高，感染ASFV強毒株后致死率可高達100%[1]。ASFV首次在非洲肯尼亞地區發現，2007年擴散到亞美尼亞等地，隨后在北歐各國相繼發生[2]。我國首例病例于2018年10月發生在遼寧省沈陽市沈北新區，之后在國內各地區廣泛暴發和流行，嚴重影響了我國的養豬業，目前已被農業農村部列為一類動物疫病[3]。現階段市場上流行的ASF疫苗尚未經過政府相關部門的認可，且保護率還有待提高，因此對ASF的疫病防控應及時采取早期預防、及時撲殺和阻斷傳播等有效方式[4]。所以，確立靈敏度高的測定手段是該病的重要預防和控制方案之一。作為非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬唯一的病毒種類，ASFV的直徑為175 nm～215 nm，是一種二十面體帶囊膜的雙鏈DNA病毒。該病毒的遺傳物質大小介于170 kb～190 kb，其中含有151個開放閱讀框，遺傳物質可以編碼150～200個蛋白[5-7]。本研究通過構建重組原核質粒pGEX-6P-1-p54，進行原核表達，優化表達條件，確立測定ASFV抗體的間接ELISA方法，為深入探究ASFV測定試劑盒打下夯實的基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內切酶均購自中國大連寶生物試劑有限公司，GST標簽蛋白純化試劑盒購自美國Clontech公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Sigma公司，GSH-瓊脂糖凝膠預裝柱購自生工生物工程(上海)股份有限公司，HRP標記的山羊抗豬IgG、山羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司，pGEX-6P-1原核表達載體由錦州醫科大學實驗動物中心提供和保存，ASFV-p54基因質粒、非洲豬瘟陰性和陽性血清、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒陽性血清均由國家外來動物疫病研究中心提供和保存。

1.2 引物的設計與合成

根據GenBank(序列號：NC_044943.1)公布的ASFVp54的基因序列設計1對特異性引物，上游引物p54-F序列：5′-CATATGATGGAT TCTGAATTTTTTCA-3′，下游引物p54-R序列：5′-AAGCTTTTACAAGGAGTTTTCTAGGT-3′，擴 增片段大小為552 bp。為了方便構建質粒，給引物添加相應的酶切位點(BamHI，XhoI)，引物由上海生工合成。

1.3 ASFV-p54重組質粒的構建

以ASFV-p54基因質粒為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。目的片段用DNA凝膠回收與純化試劑盒(TaKaRa)進行回收純化。將回收純化的目的基因片段與相同酶切位點酶切回收的pGEX-6P-1載體在16 ℃下連接過夜，連接產物轉化DH5α感受態細胞，涂于LB瓊脂平板上(含80 μg/mL氨芐西林)，37 ℃下恒溫過夜培養。次日，選擇長勢狀態良好的單個菌落，將其接種到5 mL的LB液體培養基中(該培養基含有濃度為80 μg/mL的氨芐西林)，37 ℃ 170 r/min培養至對數生長期，菌液PCR和雙酶切鑒定正確后，送去測序。PCR反應體系如下(25 μL)：ddH2O 19.75 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1.0 μL，引物(10 μmol/L) 0.5 μL，ExTaq 0.25 μL，cDNA 1.0 μL。其相關條件參數設置為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，30個循環，72 ℃ 10 min。

1.4 重組質粒的誘導表達

將連接產物pGEX-6P-1均勻涂于LB瓊脂平板上(含80 μg/mL氨芐西林)，37 ℃過夜培養。次日，選取長勢狀態良好的單個菌落，將其接種到5 mL的LB液體培養基(含100 μg/mL氨芐西林)中，37 ℃，200 r/min至OD600nm為0.5時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導表達，之后繼續振搖培養數小時后收菌(初步誘導表達條件為：IPTG至終濃度 1.0 mmol/L、30 ℃、220 r/min震蕩6 h后收菌[7])。

1.5 誘導表達條件的優化

將目的蛋白誘導的三個重要條件進行優化，將溫度(20 ℃、24 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃)、IPTG終濃度(0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L)、誘導時間(0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h)設置梯度，聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gellectrohoresis，SDSPAGE)分析，通過灰度掃描，最終確定誘導表達的最佳條件。

1.6 重組蛋白的收集純化

收集誘導后的菌液，5 000 r/min下離心20 min，棄盡上清，依據菌液沉淀量加入適量磷酸緩沖液。經超聲波破碎(一次超聲10 s，間歇10 s，直至溶液澄清)后，放入低溫超速離心機中離心，12 000 r/min，4 ℃，30 min，收集上清液于4 ℃下保存。使用還原性谷胱甘肽瓊脂糖凝膠預裝柱對收集的上清液進行蛋白純化，用BCA法測定蛋白含量。

1.7 SDS-PAGE與免疫印跡檢測

將純化蛋白進行SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍染色后觀察分析，同時將重組蛋白轉移到PVDF膜上，4 ℃過夜封閉，使用ASFV陽性血清為一抗，HRP標記的兔抗豬IgG與山羊抗兔IgG為二抗分別進行雜交1 h，最后ECL顯色。

1.8 建立間接ELISA方法

1.8.1 確定重組蛋白最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數

使用方陣滴定試驗明確最好的反應環境條件，將純化后的重組蛋白的濃度調整到38.4 μg/mL、19.2 μg/mL、9.6 μg/mL、4.8 μg/mL、2.4 μg/mL、1.2 μg/mL、0.6 μg/mL，包被96孔板，100 μL/孔，4 ℃過夜。每孔加入200 μL封閉液，37 ℃下孵育1 h。ASFV陽性血清和陰性血清為一抗，分別稀釋到1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，100 μL/孔，37 ℃下孵育1 h。HRP標記的山羊抗豬IgG為二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育10 min，之后加入顯色終止液，酶標儀上機讀數，根據P/N值確定最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數。

1.8.2 特異性試驗

選取豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒的陽性血清，每個10份，并設定ASFV陽性血清和相關的陰性對照，使用已經優化的條件進行間接ELISA檢測。

1.8.3 靈敏度試驗

將ASFV陽性血清依照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的要求進行調整，使用優化后的條件對其進行間接ELISA測定，明確陽性血清需要稀釋的最大數值。

1.8.4 重復性試驗

組內重復性試驗：用同一次包被的96孔板檢測ASFV血清10份，每份做5個復孔；組間重復性試驗：用5次包被的96孔板檢測ASFV血清10份。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

利用設計的引物成功擴增AFSVp54基因，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到522 bp長度的目的片段(圖1)，與設計結果一致。將目的基因連接至pGEX-6P-1原核表達質粒，得到pGEX-6P-1-p54質粒，經BamHI、XhoI雙酶切鑒定(圖2)及測序結果，顯示pGEX-6P-1-p54重組質粒構建成功。

2.2 重組質粒的誘導表達

將重組質粒與pGEX-6P-1空載體分別進行轉化試驗，在大腸桿菌BL21中進行誘導表達，同時用未誘導菌作為陰性對照組，SDSPAGE分析蛋白表達水平。結果顯示，pGEX-6P-1空載體表達GST標簽為26 kDa，與GST標簽重組的蛋白分子量約為46 kDa，與理論值一致(圖3)。

2.3 表達條件的優化確定

將目的蛋白誘導的溫度、IPTG終濃度、誘導時間三個條件進行優化，經SDS-PAGE分析，結果表明當誘導溫度為30 ℃，IPTG濃度為0.8 mmol/L、離心速度為220 r/min、反應時間為8 h時，表達量最大(圖4、圖5、圖6)。

2.4 免疫印跡檢測重組蛋白

在試驗中，分別用GST標簽抗體和ASFV陽性血清為一抗，對重組蛋白進行免疫印跡分析。結果顯示，優化后的重組蛋白與GST抗體和ASFV陽性血清均發生特異性反應，在46 kDa處均有明顯特異性條帶(圖7、圖8)，兩次結果與SDS-PAGE分析結果和蛋白分子量計算值一致。

2.5 間接ELISA條件的確定

2.5.1 重組蛋白最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數

將上述已經純化好的重組蛋白按照38.4 μg/mL、19.2 μg/mL、9.6 μg/mL、4.8 μg/mL、2.4 μg/mL、1.2 μg/mL、0.6 μg/mL的指標進行調整，ASFV陽性血清和陰性血清為一抗，分別稀釋到1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，結果如表1所示，抗原包被濃度最終需要調整到1.2 μg/mL，血清稀釋程度達到1∶100時該物質的OD450nm值接近于1，在這個過程中P/N值是高的，所以重組蛋白最好的包被濃度需要達到1.2 μg/mL，血清最佳稀釋倍數1∶100。根據OD450nm的x-值，被檢測樣本大于0.313可以評判為陽性，低于這一數值可以評判為陰性。

2.5.2 特異性試驗

用建立的ELISA方法分別以豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒的陽性血清學為一抗，進行對比測定，結果如圖9所示。六種病毒的血清OD450nm值均低于0.313，檢測結果均為陰性，證明建立的ELISA方法具有良好的特異性。

2.5.3 特異性試驗

將ASFV陽性血清(原始濃度為38.4 μg/mL)按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的倍數進行稀釋，采用優化后的條件進行間接ELISA檢測，其數據如圖10所示。由圖10可知，當該病毒陽性血清稀釋到1∶1 600時，OD450nm值依然高于0.313，證明建立的ELISA方法具有較好的敏感性。

2.5.4 重復性試驗

分別通過組內重復性試驗與組間重復性試驗，結果如圖11所示，組內變異系數與組間變異系數都小于10%，這證實所建立的ELISA方法具有比較可觀的重復性。

3 討論

ASF屬于一類熱性、出血性傳染病，臨床主要以高熱、淋巴結及臟器嚴重出血為特征，具有較高的接觸傳染性，所有品種和年齡段的豬均可感染，發病率和死亡率較高，ASFV強毒株的致死率可達100%，嚴重威脅全球養豬業。目前ASF尚無有效的預防和治療措施，所以規模化豬場需要結合早期檢測和實時監控等方法方能有效防控ASF[8]。ASF與經典豬瘟、豬丹毒等疾病具有相似的臨床癥狀，在進行鑒別診斷時，可以采用病毒分離、血清學檢測、免疫熒光法、免疫組化法以及核酸檢測等多種比較常見的方法，目前血清學檢測法已得到了廣泛的應用，不僅所需成本低，而且具有較高的準確性，便于操作處理，適用于大多數豬場實驗室進行診斷操作，所以建立一種靈敏度高且特異性強的ASFV血清學檢測方法有助于ASF的防控[9-11]。目前，在實驗室常規的血清學診斷方法中，OIE首選ELISA方法作為診斷ASFV的血清學方法，該方法具有操作簡便、特異性較好、靈敏度高的特點，對實驗室的硬件和實驗人員的操作水平要求較低，可同時檢測大批量樣本。

經研究發現，ASFV表達的蛋白多達150余種，其中p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白具備血清學診斷價值[12-14]。p54蛋白主要位于病毒的內囊膜上，具有良好的免疫原性。同時，p54蛋白在病毒衣殼的運輸和誘導細胞凋亡方面發揮重要作用[15]。所以，重組蛋白p54可以作為良好的診斷抗原，用于ASFV感染中期或者后期的血清學診斷。

本研究主要參考了發布于GenBank上的從中國的發病豬上分離的ASFVp54基因序列，并優化大腸桿菌密碼子，在全序列克隆基因之后，通過原核表達的方式，對可溶性重組蛋白GST-p54進行表達，且該蛋白的反應原性較佳。通過對p54蛋白原核表達體系的探索，建立了大量制備可溶性p54蛋白的體系，可用于后續的抗體制備、ELISA試劑的研制以及蛋白結晶的解析等，具有潛在的應用研究和基礎研究價值。

本研究選擇的包被抗原——GST-p54重組蛋白，通過優化反應條件，構建了ASFV抗體間接ELISA檢測方式。試驗結果表明，此種方式具有良好的重復性與敏感性，而且特異性較佳，具有重要的研究意義。