豬圓環病毒2型滅活疫苗安全性及免疫效力的評價

何錫忠，趙本進，林 鷙，朱永軍，李嘉皓，丁衛星，彭麗英*

(1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201403)

豬圓環病毒病是由豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)引 起的傳染性疾病，已給全世界養豬業造成了巨大的經濟損失，其臨床表現主要是以斷奶仔豬多系統衰竭綜合征為主[1-2]。該病主要發生在7～15周齡的斷奶仔豬，發病率4%～30%，死亡率可達50%～90%[3-4]，PCV2感染豬后可對機體的免疫系統產生免疫抑制作用[5]。目前對于PCV2引起的豬圓環病毒病尚無有效的治療方法，且該病毒對外界抵抗力強，造成豬場凈化難度高。豬圓環病毒病防控的主要手段是對豬接種疫苗。滅活疫苗的安全性高，所以滅活疫苗仍然是當前主要的疫苗研發類型，但其免疫效果卻不十分理想[4]。

本試驗是將所制備的豬圓環病毒2型滅活疫苗接種豬后對其安全性及免疫效力進行評價。

1 材料

1.1 疫苗

豬圓環病毒2型疫苗，批號分別為20200401、20200409和20201001，由上海佳牧生物制品有限公司制備。

1.2 試驗動物

21日齡的健康易感仔豬(用豬圓環病毒2型特異性PCR方法檢測PCV2基因、PCV2抗體均為陰性)，購自江蘇省茅山鎮某家實驗動物養殖場。

1.3 豬圓環病毒2型

豬圓環病毒2型SN07-12株(滴毒，TCID50107.33/mL)，由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所制備、鑒定和保存。

1.4 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、PCV2間接免疫熒光試劑盒(韓國JBT生物技術公司)、Retiga 2000R高敏感度冷CDD熒光數碼顯微鏡(日本OLYMPUS)、GeneAmp9700-PCR擴增儀(美國AppliedBiosytems公司)、紫外凝膠成像系統(法國 Vilber Lourmat)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.5 PCR方法

PCR引物P1：5'－AAGAGAAATGGCATCTTCAACACC-3'，P2：5'－CAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3'，條帶大小為580 bp。反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環，72 ℃ 7 min。

2 方法

2.1 安全性試驗

將21日齡健康易感仔豬(PCV2抗原和抗體檢測均為陰性)20頭分為4組，每組5頭，3組為免疫組，1組為對照組。免疫組仔豬頸部肌內注射疫苗，2.0 mL/頭，隨后觀察14 d內的采食、飲水、精神是否正常，有無不良臨床反應，注射部位有無異常反應。免疫前3 d和免疫后10 d內，測量體溫。免疫后14 d，從免疫組和對照組各選擇2頭仔豬進行剖檢，觀察各臟器有無病理變化。

2.2 免疫效力試驗

取21日齡健康易感仔豬(PCV2抗原和抗體檢測均為陰性)25頭，分為5組，每組5頭，第1～3組為免疫組，第4組接種安慰劑，為攻毒對照組，第5組不免疫不攻毒，為空白對照組，各組分別隔離飼養。免疫組仔豬頸部肌內注射疫苗 1.0 mL/頭，首免后隔14 d用相同劑量加強免疫一次，二免后18 d分別在每頭仔豬的兩側腋下和臀部注射1.0 mL弗氏不完全佐劑乳化的鑰孔血藍蛋白(KLH/ICFA、0.5 mg/mL)，同時腹腔接種巰基乙酸培養基，10 mL/頭。

2.2.1 PCV2抗體水平檢測

二免后第21天對所有仔豬采血，分離血清，用無血清培養基將PCV2稀釋為103.5TCID50/mL，接種于單層PK-15細胞，置培養箱中培養48 h，80%冷丙酮固定細胞30 min。采用免疫熒光方法檢測待檢血清的PCV2抗體水平，熒光顯微鏡下見綠色特異性熒光為陽性，無綠色特異性熒光為陰性，出現特異性熒光的血清最高稀釋倍數為抗體效價。根據抗體效價檢查結果進行判定，免疫組至少4頭仔豬的PCV2抗體效價不低于1∶ 1 600，攻毒對照組及空白對照組仔豬的檢測結果均陰性(不高于1∶400)。

2.2.2 免疫攻毒

二免后第21天，用PCV2 SN07-12強毒株(病毒含量為TCID50107.33/mL)對各免疫組和對照組仔豬進行攻毒，滴鼻1.0 mL、頸部肌內注射8.0 mL，逐日測量體溫并觀察25 d。攻毒后第4天分別在每頭仔豬的兩側腋下及臀部注射1.0 mL弗氏不完全佐劑乳化的鑰孔血藍蛋白(合計4.0 mL/頭)，同時腹腔接種巰基乙酸培養基10 mL/頭；攻毒后第11、19天再次腹腔接種巰基乙酸培養基10 mL/頭。觀察期結束時，將試驗仔豬稱重后撲殺，采集每頭仔豬的腹股溝淋巴結，通過免疫組化法對PCV2抗原進行檢測[4]。根據體溫、平均日增重和病毒抗原檢查結果進行判定，免疫組應至少4頭仔豬受到保護，攻毒對照組應至少4頭仔豬發病。

2.2.3 PCV2病毒檢測

PCR法按照中國動物衛生與流行病學中心提供的豬圓環病毒聚合酶鏈式反應檢測試劑盒說明書進行。

免疫組化法是將各組仔豬的腹股溝淋巴結浸泡于2.5%戊二醛-多聚甲醛混合液中固定，8 h～12 h后將固定好的組織修剪成適當大小的塊，按免疫組化法[6]進行PCV2檢測。

2.3 仔豬發病的判定標準

2.3.1 體溫

仔豬體溫升高(≥40℃)(每日上午9點左右測定仔豬體溫一次)，至少持續3 d。

2.3.2 平均日增重

攻毒當日和攻毒結束日，分別對各組仔豬進行稱重，計算攻毒后各組仔豬的平均日增重，若攻毒仔豬的平均日增重低于空白對照組仔豬的，且差異顯著(P＜0.05)，判該組仔豬生長發育不良，均有臨床癥狀。

2.3.3 病毒抗原檢測

用常規免疫組化法檢測仔豬腹股溝淋巴結的PCV2抗原。

符合2.3.1、2.3.2、2.3.3中的任何2項，即可判為發病。

3 結果

3.1 安全性試驗結果

3.1.1 體溫測定

3批次疫苗免疫后，免疫組仔豬每日每頭測得的體溫均低于40 ℃，與對照組仔豬的相似，體溫處于正常范圍內(表1)。

3.1.2 臨床觀察

由表2可知，3批次疫苗免疫后觀察14 d，仔豬采食、精神狀態均正常，被毛整潔有光澤，均無不良臨床反應，疫苗吸收良好，注射部位均無紅腫、硬塊等局部異常反應，與對照組仔豬相比無明顯差異。

3.1.3 剖檢

免疫后14 d各組隨機選1頭仔豬剖檢，觀察仔豬各臟器病理變化。結果顯示，免疫組及對照組仔豬各臟器均無病理變化(表3)。

3.2 效力試驗結果

3.2.1 抗體測定

由表4可知，豬圓環病毒2型滅活疫苗二免后3周，各批次疫苗免疫仔豬的抗體效價均不低于1∶1 600，攻毒對照組及空白對照組每頭仔豬的抗體效價不高于1∶400。

3.2.2 臨床觀察

如表5所示，攻毒后14 d內逐日測量各組仔豬的體溫，并進行臨床觀察，各批次疫苗免疫仔豬后均無不良臨床反應，每日每頭仔豬的體溫均不高于40 ℃，與空白對照組仔豬的差異不顯著(P＞0.05)；攻毒對照組有部分仔豬在攻毒后3 d～5 d體溫略有升高，其中體溫高于40 ℃持續3 d。

3.2.3 平均日增重、剖檢以及PCR方法和免疫組化法檢測結果

攻毒后25 d對各組仔豬稱重，并計算仔豬的平均日增重。結果表明，3批次疫苗免疫組、攻毒對照組及空白對照組仔豬攻毒后的平均的日增重分別為(0.533±0.012)kg、(0.534±0.014)kg、(0.537±0.011)kg、(0.492±0.009)kg、(0.532±0.018)kg，免疫組與空白對照組之間差異不顯著(P＞0.05)。攻毒后25 d剖檢所有試驗仔豬，3批次疫苗免疫組、攻毒對照組及空白對照組仔豬各臟器均未發現病理變化，通過PCR方法及免疫組化法對腹股溝淋巴結檢測PCV2時發現，3批次疫苗免疫組和空白對照組仔豬的檢測結果均為陰性，攻毒對照組仔豬也均為陽性(表6)。

4 討論

安全性試驗表明，仔豬以2倍劑量接種3批次疫苗后，體溫、采食量、毛色、精神狀態均正常，生長發育良好，無異常臨床反應，符合疫苗安全要求。

潘杰等發現，在二免2周后，該疫苗不僅能提高仔豬體液免疫水平，誘導高效特異性抗體產生，而且能夠有效抵抗強毒株的攻擊，保護率可達100%[6]。本研究從攻毒后試驗仔豬的體溫變化、平均日增重、抗體水平、PCR方法及免疫組化法等方面對疫苗免疫保護效果進行了評價。結果表明：免疫組及空白對照組仔豬體溫正常，毛色整潔有光澤；攻毒對照組仔豬體溫升高(高于40 ℃)持續3 d，毛色紊亂無光澤。攻毒后25 d剖檢，各組仔豬均無特征性的豬圓環病毒病的病理變化；但是免疫組及空白對照組仔豬的平均日增重大于攻毒對照組仔豬的；免疫組每頭仔豬的抗體效價均不低于1∶1 600，攻毒對照組及空白對照組每頭仔豬的抗體不高于1∶400；在用PCR方法和免疫組化法檢測PCV2上，免疫組均為陰性，而攻毒對照組均為陽性。依據仔豬的發病標準判定免疫組保護率為100%，攻毒對照組保護率為0。由此可見，豬圓環病毒2型滅活疫苗能夠有效預防豬圓環病毒2型強毒株對豬的侵入。