海藻酸鈉腸溶包被氧化鋅微球的制備

曹清貽，李寶霞，肖美添，陳嘉偉

（華僑大學化工學院化學工程與制藥工程專業，福建 廈門 361021）

鋅是動物必需的微量元素之一，參與300多種酶的合成，與動物腸道發育和免疫功能密切相關。目前的研究認為氧化鋅是鋅可以抵抗腸道疾病的唯一無機形式[1]。許多研究和實踐經驗表明，在斷奶仔豬日糧中添加一定劑量的氧化鋅可以降低腹瀉的發生率，提高仔豬的生長性能[2-3]。但仔豬日糧中的氧化鋅很容易被胃里的酸性胃液分解，大部分氧化鋅轉化為Zn2+，隨糞便排到環境中，只有10%～25%的氧化鋅能到達腸道，被仔豬吸收[4]。所以仔豬日糧中必須添加高劑量的氧化鋅（質量分數2～3 g/kg）才能有效抑制仔豬腹瀉[2-3]。鋅在土壤中的過量積累會導致土壤質量惡化，對植物產生毒性，并可能危害動物和人類健康[5-7]。根據農業部的《飼料添加劑安全使用規范》（農業部公告第2625號），仔豬斷奶后前2周允許添加的氧化鋅的質量分數最高不超過1.6 g/kg，相比2009年頒布的添加標準質量分數2.25 g/kg顯著降低[8]。因此，研制符合規范要求的氧化鋅添加劑迫在眉睫。

對氧化鋅進行包被處理，包衣層能夠保護氧化鋅不被胃液降解，而在腸道釋放并被仔豬吸收，可以有效提高氧化鋅的利用率，顯著降低飼料中氧化鋅的添加量[9-12]。

海藻酸鈉（SA）是褐藻中發現的一種天然無毒多糖[13]。它具有成本低、生物相容性好和可降解等優點，已廣泛應用于藥物載體，它具有pH 敏感性，在高pH時易溶解[14-45]。殼聚糖（CTS）是一種廣泛應用于胃腸道給藥載體的生物聚合物[16]。它具有良好的生物相容性和生物降解性，且易于改性，常用于輸送藥物和生物活性化合物[15]。SA 與CTS可在溫和條件下瞬間膠凝，形成聚合膜膠囊[17]；還可與2 價陽離子如Ca2+、Ba2+等（除Mg2+）交聯反應形成“蛋格”結構而瞬時凝膠化，從而形成凝膠微球[18]。SA屬于腸溶性囊材，所以CTS-SA微膠囊具有一定的耐酸性和腸溶性[23]。SA 微球已廣泛應用于生物技術和制藥工業[13]。

徐文俊的實驗結果表明，CTS-SA微囊能夠顯著降低微囊在胃液中的釋放度，在模擬胃液中處理2 h，微囊的釋放率不超過22%，而在模擬腸液中，4 h后微囊的累計釋放率達到87%，6 h后可完全釋放[19]。還有許多實驗證明，CTS-SA 包被微球可以減少藥物在模擬胃液中的釋放，但可以加速藥物在模擬腸液中的釋放[20-22]。

本研究采用SA、CTS、氯化鈣作為包被材料制取腸溶包被氧化鋅微球，以期獲得以SA和CTS作為載體制取包被氧化鋅的優化配方及工藝條件，為降低仔豬飼料中氧化鋅添加量提供有效方法和替代產品。CTS-SA包被氧化鋅腸溶微球

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氧化鋅，無水氯化鈣，CTS，乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA），磷酸二氫鉀，氫氧化納，分析純；SA，化學純。

電子天平，HZK-FA210S；pH 計，ST2100；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S；智能崩解儀，ZB-1E。

1.2 微球制備方法

采用銳孔凝固浴法制備CTS-SA包被氧化鋅腸溶微球[23]。將SA（1～5 g）融入100 g 熱水中，用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min，使SA 完全溶解。將氧化鋅（10～30 g）加入到已溶解的SA 溶液中，恒溫均勻攪拌15 min，然后用注射器將混合物滴入到氯化鈣溶液（質量分數1%～5%）中，使其攪拌交聯2 h后固化，再進行抽濾之后分離微球。之后將微球轉移到CTS 溶液（質量分數0%～0.5%）中，繼續攪拌交聯2 h后抽濾，分離微球并用蒸餾水洗滌，干燥至恒量，得到包被微球。

實驗過程中以SA、氯化鈣、CTS 的質量分數分別為3%、3%、0.25%，氧化鋅投加質量分數20%作為基本的實驗條件，改變單一條件制備一系列微球。

1.3 氧化鋅含量分析

采用GB/T4372.1－2014 中的Na2EDTA 滴定法來測定微球中氧化鋅含量[24]。

1.4 微球的體外釋放

氧化鋅的體外釋放參照《中國藥典（2010版）》附錄XD釋放度測定法中腸溶制劑項下方法一的要求，對微球進行體外釋放研究[25]。將1 g 微球放入模擬胃液中，溶出介質溫度定在(37±0.5)℃，每隔一定的時間取樣5 mL，用微孔濾膜過濾，并補入等量模擬胃液原液。2 h 后將上述微球放入模擬腸液中，每隔一定的時間取樣3 mL，用微孔濾膜過濾，并補入等量模擬腸液，繼續運轉2 h。

模擬胃液。在清水中，滴加鹽酸，至溶液pH為1.5，得到溶液500 mL。

模擬腸液。稱量6.8 g KH2PO4于500 mL 的清水中，用NaOH溶液將溶液調成pH為6.8。

1.5 微球的質量評價

采用光學顯微鏡對微球形態的觀察。

測定粒徑大小采用顯微計數法，在光學顯微鏡下，隨機測定3個微球的大小，得到微球的平均粒徑。

根據《藥典》附錄中“微囊、微球與脂質體制劑指導原則”部分關于2個概念的定義可知[24]：

包封率=系統中包封的藥物質量/系統中包封與未包封的總質量；

載藥量=微球中所含藥物質量/微球的總質量；

收率=微球的總質量/總投加質量。

2 結果與討論

2.1 SA含量的影響

固定氯化鈣、CTS 的質量分數分別為3%、0.25%，氧化鋅投加質量分數為20%，制備SA 的質量分數分別為1%、3%、5%的微球。所得微球形貌見圖1。

圖1 SA含量對微球形貌的影響Fig1Effectof SAconcentrations onmorphologyof microspheres

由圖1可知，當SA的質量分數為1%時，微球成橢圓狀，可能是因為低含量的SA 的黏度比較小，而導致微球的變形。而當SA 的質量分數為5%時，微球不成球狀接近水滴狀，可能是SA含量過高時其黏度比較大，物料乳化不均勻。所以不再進行SA 的質量分數為5%時的其它因素（載藥量、包封率、體外釋放量等）的實驗。

SA 含量對微球的體外釋放程度的影響如圖2所示。

圖2 SA含量對微球的體外釋放程度的影響Fig 2 Effect of SA content on in vitro release of microspheres

微球在模擬胃液中2 h 內不崩解。由圖2 可知，在進入模擬腸液2 min內就開始溶解。當微球中SA 的質量分數為1%時，微球溶解率增加緩慢，50 min后趨于平衡，微球溶解完畢，總體溶解率很低；當微球中SA 的質量分數為3%時，微球溶解率在20～30 min 時增加迅速，50 min 趨于平衡，微球完全溶解完畢。因此SA 的質量分數為3%時的微球在模擬腸液中的釋放度較好。

SA含量對微球的特性的影響見表1。

表1 SA含量對微球的特性的影響Tab 1 Effect of SA content on properties of microspheres

由表1 可知，當SA 的質量分數從1%增至5%時，微球的粒徑分布逐步變寬。，SA的質量分數為1%、3%時，SA 微球在模擬胃液中均不溶。SA 的含量對微球在腸液中完全釋放的時間幾乎沒有影響。所以當SA 的質量分數在3%左右時制得的微球較為理想。

2.2 氯化鈣含量的影響

固定SA、CTS 的質量分數分別為3%、0.25%，氧化鋅投加質量分數為20%，制備氯化鈣質量分數分別為1%、3%和5%的微球。氯化鈣含量對微球的體外釋放程度的影響見圖3。

微球在模擬胃液中2 h內不崩解。由圖3可知，進入模擬腸液2 min 內就開始溶解，且在20～30 min直接溶解率增速最大。當氯化鈣的質量分數為1%時，微球溶解率在40 min 之后趨于平衡，50 min后微球溶解完畢，在40 min 之后曲線下滑的原因可能是隨著時間的延長氧化鋅逐漸沉淀從而導致溶液含量降低；當氯化鈣的質量分數為3%或5%時，微球溶解率均在40 min后趨于平衡，且微球分別在60 min 和70 min 后完全溶解完畢。因此氯化鈣的質量分數為3%時的微球在模擬腸液中的完全釋放釋放時間較5%的短，且兩者載藥量相差不大。

圖3 氯化鈣含量對微球體外釋放的影響Fig 3 Effect of CaCl2 concentrations on in vitro release of microspheres

氯化鈣含量對微球的特性的影響見表2。

表2 氯化鈣含量對微球的特性的影響Tab 2 Effect of CaCl2 content on properties of microspheres

由表2 可知，當氯化鈣的質量分數從1%增至3%時，微球包封率明顯增加，這可能是氯化鈣的含量適當的上升對交聯反應的發生有正向作用；但隨著氯化鈣含量的持續上升，包封率沒有明顯增加。氯化鈣的質量分數分別為1%、3%、5%時，微球在模擬胃液中均不溶。氯化鈣含量對微球在模擬腸液中的釋放時間影響不大，但當氯化鈣含量相對較高時，其對微球性質有一定影響，所以之后的實驗可以選擇氯化鈣的質量分數為3.5%、4%和4.5%做進一步考察。

2.3 CTS含量的影響

固定SA、氯化鈣的質量分數均為3%，氧化鋅投加質量分數為20%，制備CTS 質量分數分別為0%、0.25%和0.5%的微球。CTS 含量對微球的體外釋放程度的影響見圖4。

圖4 CTS含量對微球的體外釋放程度的影響Fig 4 Effect of CTS content on in vitro release of microspheres

微球在模擬胃液中2 h內不崩解。由圖4可知，進入模擬腸液2 min 內就開始溶解，在20～30 min之間溶解率增速最快。當CTS 的質量分數為0 時，微球溶解率在40 min 之后趨于平衡，溶解完畢。在50 min 之后曲線下滑的原因可能是隨著時間的延長，氧化鋅逐漸沉淀從而導致溶液中含量降低，且氧化鋅釋放量較低，包封率較低；當CTS的質量分數為0.25%時，微球溶解率在60 min后趨于平衡，微球溶解完畢；當CTS 的質量分數為0.5%時，微溶解率在80 min 后趨于平衡，溶解完畢。因此CTS的質量分數為0.25%時的微球在模擬腸液中的釋放量較好。

CTS含量對微球特性的影響見表3。

表3 CTS含量對微球的特性的影響Tab 3 Effect of CTS content on properties of microspheres

由表3可知，若原料配方含CTS，則微球的包封率明顯高于不含CTS 的。當微球的CTS 的質量分數從0.25%升至0.5%時，包封率下降，這可能是CTS含量過高，導致CTS與SA發生聚集，因此包封率下降。CTS的質量分數分別為0、0.25%、0.5%時，微球在模擬胃液中均不溶。隨著CTS含量的增加，微球在模擬腸液中完全釋放所需要的時間明顯增加。因此，當CTS的質量分數在0.25%左右時，可以制得比較理想的微球。之后做進一步考察實驗時可以選擇CTS的質量分數為0.2%和0.3%。

2.4 氧化鋅投加量的影響

固定SA、氯化鈣、CTS 的質量分數分別為3%、3%、0.25%。氧化鋅投加質量分數分別為10%、20%和30%微球。氧化鋅投加量對微球的體外釋放程度的影響如圖5所示。

圖5 氧化鋅含量對微球的體外釋放的影響Fig 5 Effect of ZnO content on in vitro release of microspheres

微球在模擬胃液中2 h 內不崩解。由圖5 可知，進入模擬腸液2 min 內開始溶解，溶解率在20～30 min之間增加迅速。當氧化鋅投加質量分數10%時，微球在60 min之后溶解完畢，在60 min之后曲線略有下滑的原因可能是隨著時間的延長，氧化鋅逐漸沉淀從而導致溶液中含量降低；當投加質量分數為20%時，微球溶解率在30～60 min仍然繼續增加，60min 后趨于平衡，微球溶解完畢；當投加質量分數為30%時，微球溶解率在30 min 之后增加緩慢，70 min 后趨于平衡，溶解完畢。因此，氧化鋅投加質量分數為10%時的微球在模擬腸液中的釋放量最好。

氧化鋅投加量對微球特性的影響見表4。

由表4可知，隨著氧化鋅投加量的上升，微球粒徑顯著增大，包封率下降，在模擬腸液中完全釋放的時間變長。由實驗可知，氧化鋅投加質量分數分別為10%、20%、30%時，在模擬胃液中均不溶。之后的實驗可以選擇選擇氧化鋅投加質量分數分別為15%和25%做進一步考察。

3 結 論

以氧化鋅為主要藥物，SA 為載藥載體，制備SA 腸溶包被氧化鋅微球。通過單因素考察得到的優化配方為：SA、氯化鈣、CTS 的質量分數分別為3%、3%、0.25%，氧化鋅投加質量分數為10%。在些條件下所制得的微球微球形態圓整、粒徑分布均勻、包封率相對較高，且體外釋放溶出的實驗證明微球在模擬胃酸中釋放量小于5%，可以有效避免氧化鋅在模擬胃液中被分解；在pH 為6.8 的模擬腸液中，所制得微球在0.5 h 內的釋藥量大于80%，能達到藥物的快速釋放與產生作用的目的。