Livin、Caspase-3和Bcl-2在非小細胞肺癌中的表達及意義

周蓓燁，李明才，劉 銀

（1.寧波大學醫學院，浙江 寧波 315211 ；2. 上海市肺科醫院檢驗科，上海200003）

細胞凋亡是指由基因控制的細胞自主有序的死亡。細胞凋亡與增殖之間的動態平衡可保持多細胞動物生長發育的穩定，維持組織器官結構與功能的正常[1]。細胞凋亡的過程受到抑制，導致突變的細胞不能被及時清除是導致腫瘤發生的主要原因。Livin 蛋白是IAP 家族中的一種新的獨立于Bcl-2 蛋白的抗凋亡蛋白[2]。正常組織中Livin蛋白的表達水平較低，甚至會檢測不到。而在一些腫瘤組織中可存在高水平的Livin 蛋白表達。在細胞凋亡的過程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）在執行最終的凋亡效應中起到非常重要的作用[3]。Bcl-2 家族中的Bcl-2 是一種編碼分子量為24800 的蛋白質原癌基因，具有抑制細胞凋亡的作用[4]。目前關于Livin 蛋白在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達臨床上已有大量的報道，但對于Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白這三種蛋白之間的相關性臨床上鮮有報道。本文對我院接診的110 例NSCLC 患者進行研究，旨在探討Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在NSCLC 中的表達及意義。

1 資料和方法

1.1 研究資料

本次研究選取的研究對象均為我院接診的NSCLC 患者（共110 例）。這些患者均經手術病理檢查被證實患有NSCLC。其中有男性45 例，女性65 例；其年齡為42 ～73 歲，平均年齡（65.28±5.15）歲。其中有肺鱗癌患者51 例，肺腺癌患者59 例；有高分化肺鱗癌患者17 例，中分化肺鱗癌患者22 例，低分化肺鱗癌患者12 例；有高分化肺腺癌患者32 例，低分化肺腺癌患者27 例（根據WHO《肺腫瘤組織學分型》（2000年版）[5]進行分型）。其中TNM 分期為Ⅰ期或Ⅱ期的患者有57 例，為Ⅲ期或Ⅳ期的患者有53 例（依據1997 年國際抗癌聯盟（UICC）規定的TNM 分期方法[6]進行分期）；其中有淋巴結轉移的患者有50 例，無淋巴結轉移的患者有60 例。

1.2 方法

取上述患者中60 例患者的癌組織、35 例患者的癌旁組織和15 例患者的正常肺組織進行Livin蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白表達水平的檢測（采用免疫組織化學法），具體的檢測方法是：用10% 甲醛溶液固定樣本組織，采用石蠟包埋法將其制成3 ～4μm 厚的切片，然后對切片進行Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的免疫組織化學染色和HE 染色[7]。所用試劑包括兔抗人Livin 多克隆抗體、兔抗人Caspase-3 多克隆抗體和兔抗人Bcl-2 多克隆抗體（美國SantaCruz公司），超敏SP 試劑盒和DAB 顯色劑（北京中山生物有限公司）。根據試劑盒說明書進行實驗操作，以陽性切片作為陽性對照，以正常兔IgG 代替一抗作為陰性對照。上述三種多克隆抗體以1:75 的比例進行稀釋，依次進行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化處理，孵育前置檸檬酸緩沖液進行高壓修復約90 s。用3%H2O2去離子水阻斷內源性過氧化物酶，切片孵育10min。觀察組一抗孵箱內放置90min，對照組則用PBS 替代。進行DAB 顯色和蘇木素復染，然后進行光鏡觀察。

1.3 觀察指標

上述三種蛋白的陽性反應均表現為胞漿內出現淡黃色至棕黃色顆粒，未見核表達。每張切片計數1000 個細胞，以染色強度和陽性細胞百分率為依據對三種蛋白的染色情況進行評價。首先按細胞染色強度進行評分：無著色為0 分，淺黃色（弱陽性）為1 分，棕黃色（中度陽性）為2分，棕褐色（強陽性）為3 分。然后按陽性細胞百分率進行評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞占比＜25% 為1 分，陽性細胞占25% ～50% 為2 分，陽性細胞占51% ～75% 為3 分，陽性細胞占76%～100%為4 分。上述2 項評分的乘積＞3分則判為陽性。

1.4 統計學方法

運用SPSS 10.0 軟件進行統計學分析，n ≥40 且T ≥5 時兩樣本率比較采用χ2 檢驗，n ＜40 或T ＜5 時兩樣本率比較采用Finisher 確切概率法，采用Spearman 等級相關分析法進行相關性分析，以α=0.05 為檢驗標準。用COX 比例風險模型分析Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的表達與腫瘤組織類型、分化程度、淋巴結轉移情況的關系。

2 結果

2.1 Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織、癌旁組織和正常肺組織中的表達

Livin 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織中表達的陽性率分別為84.59%、69.64%，在癌旁組織中表達的陽性率分別為2.87%、2.26%，在正常肺組織中表達的陽性率分別為0.00%、0.00%。Livin蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織中表達的陽性率均顯著高于癌旁組織和正常肺組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Caspase-3 蛋白在癌組織中表達的陽性率為42.57%，在癌旁組織中表達的陽性率為68.32%，在正常肺組織中表達的陽性率為83.19%。Caspase-3 蛋白在癌組織中表達的陽性率顯著低于癌旁組織和正常肺組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 110 例NSCLC 患者Livin 蛋白、Caspase-3蛋白和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其臨床病理特征的關系

110 例NSCLC 患 者Livin 蛋 白 的 陽 性 表達情況與其腫瘤的分化程度、組織學類型無關（P＞0.05），與其淋巴結轉移情況有關（P＜0.05）。110 例NSCLC 患者Caspase-3 蛋白的陽性表達情況和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其腫瘤的分化程度、淋巴結轉移情況有關（P＜0.05），與其腫瘤的組織學類型無關（P＞0.05）。詳見表2。

表1Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織、癌旁組織和正常肺組織中的表達[ 例（%）]

表2 110 例NSCLC 患者Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其臨床病理特征的關系（例）

2.3 110 例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白、Livin 蛋白與Caspase-3 蛋白表達水平的相關性

進行Spearman 相關性分析的結果顯示，110例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白的表達水平與其Livin蛋白的表達水平呈正相關，其Caspase-3 蛋白的表達水平與其Livin 蛋白的表達水平呈負相關。

3 討論

細胞凋亡（apoptosis）是一種由凋亡相關基因調控的為維護內環境穩定而出現的細胞自身程序化死亡[1]。機體通過細胞凋亡這一途徑可保持細胞數量的穩定、維持組織器官中凋亡與增殖細胞之間的動態平衡。細胞內源性基因、酶類都可以對細胞凋亡過程進行調控[8]。有研究表明，惡性腫瘤的發生發展不僅與原癌基因失活和癌基因激活有關，也與細胞凋亡和細胞增殖的異常有密切關系。細胞凋亡功能的損害是腫瘤發生發展的關鍵原因之一[9]。Livin 蛋白是IAP 家族中一類新的獨立于Bcl-2 蛋白的抗凋亡蛋白。Losis Miller等首次在桿狀病毒CpGV 和OP MNV 中發現了Livin 蛋白[10]。有研究指出，Livin 蛋白可通過多種途徑抗細胞凋亡[11]。相關的研究顯示，Bcl-2蛋白可抑制細胞凋亡[12]，延長細胞的生存時間，增加基因突變細胞的數量，并協助細胞逃避免疫系統的監視，從而可促進腫瘤的發生、發展[13]。本研究中發現Bcl-2 蛋白在NSCLC 癌組織中的表達水平明顯高于正常肺組織。這可能是由于Bcl-2蛋白通過抑制細胞凋亡促進了NSCLC 的發生、發展[14]。Caspase-3 屬于半胱氨酸蛋白酶Caspase家族，Caspase-3 介導的信號傳導途徑可觸發細胞凋亡。本研究中發現Caspase-3 蛋白在NSCLC癌組織中的表達水平明顯低于正常肺組織。這提示，NSCLC 的發生、發展可能與Caspase-3 蛋白的表達水平密切相關[15]。本研究的結果顯示，110 例NSCLC 患者Livin 蛋白的陽性表達情況與其腫瘤的分化程度、組織學類型無關（P＞0.05），與其淋巴結轉移情況有關（P＜0.05）。110 例NSCLC 患者Caspase-3 蛋白的陽性表達情況和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其腫瘤的分化程度、淋巴結轉移情況有關（P＜0.05），與其腫瘤的組織學類型無關（P＞0.05）。進行Spearman 相關性分析的結果顯示，110 例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白的表達水平與其Livin 蛋白的表達水平呈正相關，其Caspase-3 蛋白的表達水平與其Livin 蛋白的表達水平呈負相關。

綜上所述，Livin 蛋白、Bcl-2 蛋白在NSCLC癌組織中存在表達上調的情況，Livin 蛋白的表達與Caspase-3 蛋白、Bcl-2 蛋白的表達密切相關，三者在NSCLC 的發生發展中可能起協同作用。本研究的研究指標和樣本量有限，上述研究結論仍需通過進行大樣本的臨床研究加以證實。