結核分枝桿菌耐藥性檢測方法的研究進展

奚少勇，磨立達

〔南寧市第四人民醫院，廣西艾滋病臨床治療中心（南寧）檢驗科，廣西 南寧 530023〕

結核病是全球范圍內重要的傳染病。耐藥結核病的出現給結核病的防治帶來了嚴峻的挑戰。世界衛生組織（WHO）于2013 年重新修訂了耐藥結核病的分類（主要分為以下五類：單耐藥結核病、多耐藥結核病、耐多藥結核病、廣泛耐藥結核病和利福平耐藥結核病）[1]。2020 年，WHO就全球結核病(TB) 進行統計，數據顯示，2019 年全球新增結核病患者996 萬例，約有3.3% 的新患者和18% 的復治患者對RFP 耐藥，估算利福平耐藥結核病患者數約有46.5 萬，其中耐多藥結核病患者約占78%。我國的耐藥結核病（DR-TB）患者數約為6.5 萬，占全球的14%，相關疾控形勢相當嚴峻[2]。我國每年花費大量的資金用于治療DR-TB，但效果不夠理想，患者的死亡率較高（死亡病例數幾乎是全球結核病死亡病例數的四分之一），近年來不少菌株對貝達喹啉（Bbq）、德拉馬尼（Dlm）等新藥逐漸發生耐藥，甚至達到了無藥可用的地步[3]。耐藥結核病的診斷主要以MTB DST 檢測結果為依據。在本文中，筆者主要是對各種MTB DST 檢測方法的研究進展進行綜述。

1 表型DST 檢測方法

當前，業內一致認同MTB 耐藥性檢測必須依賴于MTB 培養。MTB 培養主要是利用絕對濃度法或比例法將菌株接種于含抗結核藥及不含藥的羅氏培養基上，根據培養基表面覆蓋菌落數量或無菌落情況判斷培養菌株是否產生耐藥性。另外，也可利用菌株在含藥和不含藥液體培養基中的生長情況來判斷其是否產生耐藥性。此方法可同時檢測其對多種藥物的耐藥性，包括一線及二線抗結核藥。然而，檢測表型DST 需使用MTB 純培養物，且MTB 存在生長較慢、有生物安全危害性的特性，這決定了該檢測方法存在費時、成本高、可比性差等缺點[4]。另外, 在培養異質性耐藥菌株時，敏感菌比耐藥菌生長快，這可能會引起耐藥漏判。

1.1 傳統的表型DST 檢測方法

目前臨床上常用的表型DST 檢測方法主要包括絕對濃度法和比例法，用這兩種方法檢測MTB耐藥性的相符性均達80% 以上，檢測RFP 耐藥性的相符性可高達90%。研究表明，在對MTB耐藥的檢出率方面，比例法優于絕對濃度法。上述傳統DST 檢測方法的優勢是可同時檢測十幾種抗結核藥物的耐藥水平、有商業化的試劑、操作簡便、檢測費用低，適于在縣級疾控中心或縣級定點醫院開展。但其同時存在較多缺點，包括檢測EMB、吡嗪酰胺(PZA)、Pto、PAS 和Cs 的結果不穩定、耗時長（培養時間通常在30 d 以上）、檢測結果易受含藥管中實際藥物濃度、MTB 懸液濃度、接種量和MTB 活力的影響等。

1.2 分枝桿菌液體培養DST 檢測法

采用分枝桿菌液體培養DST 檢測法檢測MTB耐藥性的結果與傳統表型DST 檢測方法具有較高的符合性，但檢測時間較短（通常需要8 ～10 d）[5]。WHO 已認可應用該法進行部分二線抗結核藥物〔如氧氟沙星(Ofx)、Km、Cm、Eto 等〕MTB DST檢測的效果[6]。其缺點是檢測儀器和試劑較為昂貴，且易被污染[7-8]。其優點包括可肉眼、自動化判讀結果等[9]。

2 分子DST 檢測方法

分子DST 檢測目前已被公認為是DR-TB 的確診項目之一[10]，其優點是檢測時間短(2 ～48 h)、敏感度高，能從MTB 分離株、預處理的涂陰或培陰臨床標本中檢出MTB 耐藥基因突變。需要注意的是，在進行相關標本處理或分離株前處理時存在較高的生物安全風險，但在進行標本液化時和完成DNA 提取后，安全風險是很低的。此檢測方法的其他缺點包括：1）檢測僅限于部分耐藥基因型，應用范圍受限[11]；2）難以檢出異質性耐藥[12]，表型DST 低水平耐藥菌株可能無法被檢出；3）會檢出不影響耐藥表型的同義突變( 氨基酸無改變)、沉默突變( 不影響編碼蛋白的表達)[13]，產生假陽性結果（但這種情況的發生概率很低）；4）無法檢出所有表型的MTB 耐藥菌株[14]；5）檢測成本較高。可見，此檢測方法無法替代傳統的表型DST 檢測方法，僅可起到一定的補充作用。

2.1 實時熒光定量PCR 技術

采用實時熒光定量PCR 技術進行DST 檢測具有檢測時間短、自動化程度高，既能檢測MTB 基因，又能辨別RFP 常見耐藥決定區域[15]，檢測可信度高等優點。在進行該檢測時，核酸片段提取、變性退火延伸、檢測分析產物等步驟均能實現自動化，操作不繁瑣，檢測所需時間在100 min 左右。可直接對固體或液體培養物進行檢測，除血液標本外，其他臨床標本（如痰、固/ 液培養物、肺外結核標本）均可檢測。其傳染風險低，產生氣溶膠的幾率小。但目前只能檢測RFP 的耐藥性，并不能區分具體的突變類型。

2.2 熒光PCR 探針熔解曲線法

采用熒光PCR 探針熔解曲線法可檢測MTB對多種抗結核藥物（如異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥物）的耐藥性[16]。其優點是操作簡便、檢測時間短。其缺點是檢測結果易受到探針GC 含量、金屬離子濃度、雜交溫度等多種因素的影響，且不能區分具體的突變類型。

2.3 基因芯片技術

采用基因芯片技術能快速、準確地檢測出MTB 對利福平及異煙肼的耐藥性。此技術可用于鑒別各種分枝桿菌[17]。有研究指出，利用基因芯片技術能夠快速檢出MTB 對RFP 和INH 耐藥的常見基因型，并可明確突變的具體位點和性質。進行相關檢測的耗時僅為1 ～2 d。大量的研究表明，此技術在診斷MDR-TB 中的應用價值較高。其缺點是進行雜交、檢測過程中的工序繁瑣，所需技術熟練程度較高，且試劑較貴。

2.4 反向雜交技術

利用反向雜交技術可同時快速檢測MTB 對RFP、INH、EMB、FQs、Am、Km 和Cm 的 耐藥性[18]，明確相關基因突變的具體位點和性質，并可對MDR-TB、pre-XDR-TB 和XDR-TB 進行鑒別診斷。進行相關檢測的耗時僅為1 ～2 d。但由于其屬于開放性檢測，容易產生氣溶膠，且雜交、顯色過程操作繁瑣，不易控制。

2.5 基因測序技術

利用基因測序（whole-genome sequencing,WGS）技術能夠高效便捷地檢測出MTB 對RFP和INH 的耐藥基因型，明確相關基因突變的具體位點和性質，從而能夠為精準診療提供有益參考。但進行相關檢測的準入成本較高，經驗及技術人員相對缺乏[19]，目前在基層、乃至多數地市級定點醫院尚無法廣泛開展。

3 小結

目前，無論是表型DST 檢測方法還是分子DST 檢測方法，均無法單一滿足臨床需求。低濃度MTB 易導致表型DST 檢測與分子DST 檢測的結果不一致。用表型DST 檢測方法和分子DST 檢測方法檢測RFP、INP、FQs 抗結核耐藥性的準確度較高，其他藥物的DST 檢測需結合臨床。表型DST 和分子DST 對二線抗結核藥物的DST 檢測結果均不穩定。傳統表型DST 檢測是檢測MTB 的金標準，但也有其局限性。分子DST 檢測可作為快速篩查MTB 的方法和（或）傳統表型DST 檢測的補充。采用多種方法聯合檢測能提高MTB 的檢出率、縮短診斷時間，但會增加TB 患者的檢測費用。《結核分枝桿菌耐藥性檢測專家共識》[20]中提出了一種進行MTB 耐藥性檢測的策略( 見圖1)，旨在為DR-TB 的早期明確診斷及治療提供實驗室依據。

圖1 一種進行MTB 耐藥性檢測的策略

綜上所述，對于疑似DR-TB 患者，臨床上應選擇合適的DST 方法對其進行耐藥性聯合檢測。相關研究人員應努力尋找更有效的MTB DST 檢測方法，以便為DR-TB 的快速、準確診斷和早期有效治療提供可靠的實驗室依據。