比色監控在索林乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑吸光度值監控中的應用

王 娟，張巧琳，龔 彬，楊婷婷, 王 芳，王 成

(1. 重慶市血液中心檢驗科，重慶 400015；2. 重慶市巴南區婦幼保健院檢驗科，重慶 401320；3. 奧斯邦有限公司，山東 煙臺 264000)

近年來，隨著全自動加樣系統的廣泛應用，微量檢測樣本漏加或重復加樣事件的發生逐漸減少，但仍未完全杜絕[1-4]。為防止全自動化檢測過程中檢測樣本漏加及加樣量不準的發生，采供血機構實驗室、設備廠家、試劑廠家都在積極地探討并采取各種措施，但仍未從根本上解決這一問題。比色法作為一種定量分析方法，可通過比較或測量有色化合物的顏色深度來確定待測組分的含量。有研究指出，利用此方法可有效監測酶免實驗樣本及試劑的添加情況[5-6]。ELISA 是國內采供血機構對經血傳播疾病進行篩查的主要手段。索林乙肝抗原診斷試劑中添加了有色化合物，具備利用比色法來進行添加監測的基礎。我國是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染大國[7-10]。在血液篩查中加強對HBV 的篩查具有重要的意義。在本文中，筆者主要是利用比色原理進行索林Murex HBsAg Version 3 乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑及相關樣本加樣過程的吸光度(0ptical DeInsit，OD) 值監控，旨在杜絕漏加事件的發生。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與工具

本中心無脂血、溶血的獻血標本1406 份；3個批次的索林乙肝表面抗原診斷試劑盒，批號分別 為D803110、D845110、D866910 ；Hamilton-Star 移液工作站（Hamilton，瑞士）；全自動后處理系統FAME 全自動酶免分析儀（澳斯邦，瑞士）；酶免過程監控軟件。

1.2 方法

檢測方法：嚴格按照索林乙肝表面抗原診斷試劑盒說明書進行操作，首先計算使用足量樣品稀釋液加上樣本在570 nm/620 nm 波長下的OD值；然后取樣本稀釋液加入樣本后讀數的中值，以確保設定的范圍能夠覆蓋所有的實驗結果。將未加入樣本的孔排除。同樣的原理也適用于酶結合物的監測階段。計算酶結合物490 nm/690 nm 波長下的OD 值及底物液在490 nm 波長下的OD 值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 樣本及試劑的比色監控數據

3 個批次的試劑加標本后在620 nm/690 nm波長下的平均OD 值分別為0.637、0.616、0.679，加酶后在492 nm/690 nm 波長下的平均OD 值分別為0.915、0.883、0.885，加顯色劑后在492 nm波長下的平均OD 值分別為0.145、0.147、0.145。詳見表1 ～表3。

表1 樣本及試劑的比色監控數據（批號D803110）

表3 樣本及試劑的比色監控數據（批號D866910）

表2 樣本及試劑的比色監控數據（批號D845110）

2.2 樣本及試劑加樣過程比色監控OD 值的確定

對3 個批次試劑加標本后在620 nm/690 nm波長下的平均OD 值采用SNK-q 檢驗進行兩兩比較的結果顯示，D845110、D803110 加標本后在620 nm/690 nm 波長下的平均OD 值處于同一子集中，差異無統計學意義（P＞0.05）；D866910與上述兩批次的試劑加標本后在620 nm/690 nm波長下的平均OD 值處于不同的子集，差異有統 計 學 意 義（P＜0.05）。因 此，取D845110、D803110 兩批次試劑加標本后在620 nm/690 nm波長下平均OD 值的中位數0.626 作為相應的監控OD 值。對3 個批次試劑加酶后在492 nm/690 nm波長下的平均OD 值采用SNK-q 檢驗進行兩兩比較的結果顯示，D845110、D869110 加酶后在492 nm/690 nm 波長下的平均OD 值處于同一子集中，差異無統計學意義（P＞0.05）；D803110 與上述兩批次的試劑加酶后在492 nm/690 nm 波長下的平均OD 值處于不同的子集，差異有統計學意義（P＜0.05）。因此，取D845110、D869110兩批次試劑加酶后在492 nm/690 nm 波長下平均OD 值的中位數0.881 作為相應的監控OD 值，以確保設定的范圍能夠覆蓋所有的實驗結果。對3個批次試劑加顯色劑后在492 nm 波長下的平均OD 值采用SNK-q 檢驗進行兩兩比較的結果顯示，3 個批次試劑加顯色劑后在492 nm 波長下的平均OD 值均處于同一子集中，差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，取3 個批次試劑加顯色劑后在492 nm 波長下平均OD 值的中位數0.145 作為相應的監控OD 值。

2.3 對樣本及試劑加樣過程進行比色監控的方法

使用監控軟件對樣本及試劑加樣過程進行比色監控，如實驗過程中出現OD 值低于下限的情況，軟件會報警提示加樣量不足。詳見圖1。

圖1 樣本及試劑加樣過程比色監控軟件的報警提示界面

3 討論

目前，我國現存HBV 感染者約有7000 萬例[11-12]。輸血傳播是一種重要的HBV 傳播途徑。進行嚴格的血液HBV 篩查對保障輸血安全而言至關重要[13-15]。目前，大多血站都使用高靈敏度和高特異度的ELISA 試劑及全自動的儀器進行血液HBV 篩查。但有研究發現，使用全自動檢測設備進行ELISA 實驗時自動加樣系統受多種因素的影響可能會出現加樣偏差，嚴重時甚至會出現漏加樣現象[16]。有研究表明，加樣誤差可在不同程度上影響檢測結果的準確性[17-20]。監控ELISA 實驗過程中樣本及試劑加樣量的準確性具有十分重要的意義。本研究創新性地提出利用比色法對全自動加樣儀及酶聯后處理加樣過程進行主動監控，這樣不僅可完全代替人員觀察，還能反映出各個酶標板孔加樣過程中的所有情況。本實驗共收集1406 份血液標本，根據酶聯免疫試劑盒說明書進行樣本和試劑的添加，共采用3 個批次的試劑進行了比色驗證，得出足量樣品稀釋液加上樣本在570 nm/620 nm 波長下的OD 值應該大于0.626（未達到表明稀釋液或樣本加樣不足），酶結合物在490 nm/690 nm 波長下的OD 值應該大于0.881（未達到表明加酶量不足），底物液在490 nm 波長下的OD 值應該大于0.145（未達到表明顯色液添加不足）。這與相關研究的結果相符[21-22]。本研究中不僅進行了索林乙肝診斷試劑及樣本加樣比色驗證實驗，還創新性地提出通過酶標儀比色監測OD 值的變化，進而對整個ELISA 實驗進行監控的思路，并設計了監控軟件（軟件設計思路見圖2）。監控軟件可對ELISA 實驗過程中的3 次比色結果進行抓取，并與實驗得出的準確值進行比對。將其與實驗室(LIS) 系統相連后可將數據匯總給LIS。LIS 統計數據后，可對異常值進行預警，從而可真正做到對檢測全過程進行監控并記錄。對于各讀數結果未達到臨界值的檢測，可自動判斷其結果無效。這對于提高血液HBV 的篩查質量，保證輸血安全具有重要的意義。

圖2 比色監控軟件設計思路