miR-139-5p靶向轉化生長因子-β1抑制肝癌細胞侵襲、轉移的機制

林木平，黃振華

（深圳市寶安區中心醫院，廣東 深圳 518102）

肝癌作為臨床上常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率及轉移率。此病患者的預后較差。早期肝癌患者多通過外科手術將腫瘤切除。但多數肝癌患者的臨床表現不典型，其病情極易被忽視，在得到確診時多已發展至中晚期，錯失了最佳的治療時機[1]。晚期肝癌患者腫瘤的手術切除率僅有20% 左右，且其預后欠佳，生存率較低。近年來隨著我國醫療水平的提高，放化療、靶向治療、免疫治療及納米治療等被相繼提出，在晚期肝癌的治療中取得了較好的效果[2]。人體的正常細胞通過惡變可轉變為腫瘤細胞。P53 是人體內重要的抑癌基因，可通過直接或間接作用促使細胞凋亡，從而可防止癌變的發生。miR-139-5p 不僅能與DNA 結合參與基因轉錄過程的調控，還能起到反式激活的作用，因此miR-139-5p 在調控細胞周期、加速細胞凋亡等多方面作用突出。雖然現階段臨床上對肝癌發生發展的機制進行了大量的研究，亦取得了一定的成效，但尚未達到預期，仍需進行更為深入的研究。本文主要是探討miR-139-5p 靶向轉化生長因子-β1（TGF-β1）抑制肝癌細胞侵襲、轉移的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文的研究對象是近年來在我院進行手術治療的30 例原發性肝癌患者。其納入標準是：病情符合原發性肝癌的診斷標準，且經病理學檢查得到確診；首次發病；通過手術將腫瘤切除；術前未接受過其他抗腫瘤治療；自愿參與本研究，并簽署了知情同意書。在這些患者中，有男性24例，女性6 例；其年齡為34 ～75 歲，平均年齡為（57.69±5.43）歲；其中，腫瘤TNM 分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者有17 例，為Ⅲ期和Ⅳ期的患者有13 例；肝癌組織學分類為腺癌、鱗狀細胞癌（鱗癌）、腺鱗癌的患者分別有15 例、12 例、3 例。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集與處理 分別采集30 例患者和健康體檢者的空腹靜脈血4 mL，迅速注入EDTA采血管中，輕輕混勻。在4℃下對血液標本進行10 min 的離心處理（轉速為3500 r/min），取上清液，并將其置于-80℃的冰箱中保存待用。

1.2.2 血漿中總RNA 的提取 分別吸取上述血漿樣本250 μL，加入750 μL 的Trizol 試劑，混勻后加入氯仿、異丙醇等試劑，按說明書提取總RNA。測定總RNA 純度合格后用于后續試驗。

1.2.3 反轉錄反應 按照試劑盒的說明書進行反轉錄反應，將反應后產物cDNA 置于-20℃的冰箱中保存待用。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）合成cDNA 后，用Roche 公司生產的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）熒 光 定 量PCR 試劑盒來擴增目的基因，U6 為內參基因。血漿miRNA 含量采用相對表達量2- △△Ct 表示。

1.2.5 結果判定 TGF-β1判定：1）陽性細胞染色強度：棕黃色記3 分，黃色記2 分，淡黃色記1 分，無色記0 分。2）陽性細胞數：大于75% 記3 分，介于50%～75%之間記2 分，介于25%～50%（不含50%）之間記1 分，小于25% 記0 分。3）上述兩項結果之和：6 分記（+++），4 ～5 分記（++），（++）與（+++）考慮為高表達；2 ～3 分記（+），0 ～1 分記（-），（-）和（+）考慮為低表達。

1.3 觀察指標

比較TGF-β1在肝癌組織和癌旁組織中的陽性表達率。觀察肝癌組織與癌旁組織中miR-139-5p、TGF-β1的表達情況。

1.4 統計學方法

用SPSS 22.0 軟件處理本研究中的數據，符合正態分布的計量資料（本研究中所有計量資料均符合正態分布）用±s表示，用t檢驗；計數資料用% 表示，用χ2 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1 在肝癌組織和癌旁組織中的陽性表達率

30 例患者肝癌組織中TGF-β1的陽性表達率為83.33%，其癌旁組織中TGF-β1的陽性表達率為13.33%，二者相比差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 TGF-β1 在肝癌組織和癌旁組織中的陽性表達率[例（%）]

2.2 肝癌組織與癌旁組織中miR-139-5p、TGF-β1 的表達情況

miR-139-5p 在癌旁組織中呈高表達，在肝癌組織中呈低表達， 差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。TGF-β1在肝癌組織中呈高表達，在癌旁組織中呈低表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2、圖3。

圖1 miR-139-5p 的相對值

圖2 TGF-β1 的表達水平

圖3 TGF-β1 的相對灰度值

3 討論

肝癌是一種發病率較高的消化系統惡性腫瘤。早期肝癌患者通常無特異性癥狀，中晚期肝癌患者隨著腫瘤的快速生長及肝包膜的逐漸擴增，可出現肝區疼痛（主要為刺痛、持續性鈍痛）、腹脹、納差、乏力、消瘦、腹部包塊等癥狀。研究指出，肝癌患者在出現典型的肝區疼痛癥狀時多已失去了最佳的治療時機，其病灶完全切除率不足30%[3]。腫瘤轉移是一個非常復雜的動態變化過程，常涉及相關基因的異常表達及諸多信號通路的改變。肝臟是人體合成和分泌TGF-β1的主要器官。TGF-β1是一種生物介質，具有調節細胞生長、增殖和分化等多種功能，在肝損傷的發生發展中發揮著重要作用。研究指出，在肝炎病毒或炎癥反應的反復刺激下，TGF-β1的水平可顯著升高。TGF-β1可通過增加腫瘤細胞與細胞外基質的相互作用，導致轉錄因子和相關基因共同被激活，同時減少膠原酶、基質纖溶酶等胞外基質酶的生成，誘導腫瘤細胞發生上皮- 間葉轉化（EMT），促進成纖維細胞等產生胞外基質蛋白和細胞粘附蛋白，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。本研究的結果顯示，30 例患者肝癌組織中TGF-β1的陽性表達率為83.33%，其癌旁組織中TGF-β1的陽性表達率為13.33%，二者相比差異有統計學意義（P＜0.05）。這充分證實了TGF-β1與肝癌的發生、發展密切相關。miRNAs是長度為20 ～25 個核苷酸，其在動植物中起著重要的基因調節作用，是非編碼RNA 家族的關鍵成員。miRNAs 對靶mRNA 的調控主要是通過與其3’端非編碼區域（3’-UTR）結合實現的。成熟miRNA 的形成經歷了一系列復雜的過程。首先，miRNA 被核內的RNA 聚合酶Ⅱ轉錄成初級miRNA（pri-miR-NAs），隨后RNase Ⅲ型內切酶drosha 再次切割pri-miRNAs，從而產生具有約70 個核苷酸和莖環結構的前體miRNAs（Pre-miRNAs）。Exportin-5 將Pre-miRNAs 從細胞核轉運到細胞質后，經RNase Ⅲ型內切酶Dicer 處理產生帶有兩條鏈的miR-NA 蛋白復合物，其中一條鏈將發展為成熟的miRNA，與RNA介導的沉默復合物（RISC）結合，并以目標mRNAs的3’-UTR 為靶點，調控基因轉錄后的表達。研究發現，miR-139-5p 與多種惡性腫瘤的發生、發展有關。miR-139-5p 可進行染色質修飾并沉默多個靶基因的表達是通過對多梳蛋白抑制復合體 2 （PRC2）的募集實現的。隨著肝硬化向肝癌的進展，miR-139-5p 可調控其下游的靶基因IGF1R、ROCK2 等，對抑癌因子RBI 的表達起到促進作用，使E 鈣粘蛋白從腫瘤細胞處脫落，進而降低了肝癌細胞中HOTAIR 的表達，阻斷腫瘤組織中的Notch 信號通路，抑制癌細胞的侵襲和轉移。本研究的結果顯示，miR-139-5p 在癌旁組織中呈高表達，在肝癌組織中呈低表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。TGF-β1在肝癌組織中呈高表達，在癌旁組織中呈低表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。可見，miR-139-5p 可能通過下調TGF-β1的表達來抑制肝癌細胞的侵襲、轉移。