三重實時熒光PCR法檢測急性胃腸炎聚集性疫情的探討

杜云鶴

637000 四川省南充市順慶區疾控中心，四川南充

急性胃腸炎聚集性疫情易發生在學校、托幼機構、工廠及工地等人群聚集場所，起病急、傳染性強、覆蓋面廣，導致嚴重的公共衛生問題。由于其致病病原體眾多，有細菌、病毒及寄生蟲等，而臨床表現、常規檢查及流行病學調查情況相似，給疫情的研判帶來阻礙[1-2]。在一線醫療衛生機構，特別是基層疾控中心，參與調查處置相關疫情的工作較多，因此，需要盡快建立一種快速簡單的實驗室檢測方法，為疾病預防控制工作提供實驗室技術支持。造成急性胃腸炎疫情暴發的主要因素是諾如病毒(NV)，NV 是引起人類急性非細菌性胃腸炎的重要病原體之一。NV 感染性腹瀉患者、隱性感染者及病原攜帶者均可作為本病的傳染源，急性胃腸炎潛伏期最短12 h，平均24～48 h，可以通過食物、水、生活接觸或吸入懸浮在空氣張的氣溶膠傳播，傳播速度極快，極易在短時間內造成大規模爆發流行。本次探討應用三重實時熒光PCR 法，對373 份人員及環境標本同時進行GⅠ型、GⅡ型NV和A組輪狀病毒感染情況檢測，現報告如下。

資料與方法

采集2020年11月某地一起學校急性胃腸炎聚集性疫情的疑似病例、臨床診斷病例及密切接觸者肛拭子、糞便及嘔吐物標本258 份，學校食堂餐具、教室、寢室及衛生間等環境物表拭子標本115份。

方法：肛拭子標本采用肛拭法采集，將專用采樣拭子用生理鹽水潤濕后，插入肛門2～3 cm，輕輕旋轉擦取直腸表面，需注意肛拭子上應有可見的糞便；糞便或嘔吐物標本每份取＞5 g 或5 mL，直接放入無菌干燥容器內；環境物表拭子采用涂抹法采集，用無菌拭子在病毒保存液里蘸濕，用力反復涂抹待采表面(最大面積100 cm2)，所采標本均低溫保存盡快送至實驗室。標本處理：肛拭子、糞便、嘔吐物及環境物表標本分別用旋渦振蕩器混勻后直接取200 μL 混懸液參與提取。核酸提取使用杭州博日NPA-32P 核酸提取純化儀及配套的病毒DNA/RNA 磁珠法提取試劑盒(BSC57M1B)。將室溫放置96 孔試劑板顛倒3 次，去除塑封膜后在96孔板離心機中短暫離心，避免掛液。撕去96 孔試劑板上的鋁箔膜，確認板子方向(磁珠在第6/12 列)。在第1 列及第7 列中加入200 μL 樣品，避免交叉污染。將96 孔板放入核酸提取純化儀中，裝上磁棒護套，按裂解-吸磁珠-結合-洗滌3 次-洗脫-棄磁珠的程序進行自動化提取實驗。RT-PCR 擴增反應體系及條件：檢測試劑使用北京卓誠惠生的A組輪狀病毒/諾如病毒GⅠ/諾如病毒GⅡ/三重實時熒光PCR 檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書配制擴增體系。1個反應體系含無核酸酶水2 μL、2×核酸擴增反應液10 μL、20×反轉錄酶1 μL、10×引物探針反應液2 μL，將上述反應液混勻離心后，按照每管15 μL 分裝于PCR 管中，最后加入提取的5 μL 的RNA 樣品，構成20 μL的總反應體系。陽性對照體系加入相應模板5 μL。PCR循環條件設置為45℃，20 min，1個循環；95℃，5 min，1個循環；95℃，15 s，55℃，45 s，45 個循環。在55℃延伸時收集熒光信號。報告集團分別設置為FAM、VIC及CY5，分別對應A組輪狀病毒、GⅡ型諾如病毒及GⅠ型諾如病毒的核酸檢測。

結果判定與質控：檢測儀器為Roche 羅氏Light Cycler 480Ⅱ型實時熒光定量PCR 儀。閾值設定原則為以剛好超過正常陰性對照的熒光信號最高點為閾值線。空白對照和陰性對照無擴增曲線，且陽性對照在三個檢測通道均有S型擴增曲線，實驗成立，否則判為實驗無效。若標本有S 型擴增且Ct 值≤35，根據檢測目標對應的熒光通道進行判定。若有S型擴增，且Ct 值35～40，判定為不確定標本，需重新提取核酸后進行檢測；若復檢的標本有S型擴增，且Ct值＜40，根據相應熒光通道檢測的目標病毒進行判定，否則判定為陰性。若標本無明顯S型擴增曲線，但報告有Ct值，判定為陰性。

統計學方法：采用SPSS 20.0 統計學分析系統展開數據處理；計數資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

檢出病毒核酸分布情況：在檢測的373 份標本中，共檢出NV 陽性標本144 份，分別是肛拭子、糞便及嘔吐物陽性標本共131份，環境物表拭子陽性標本13份，檢出率為38.61%；檢出A 組輪狀病毒2份，均為人員標本，檢出率0.54%；檢出NV 和A 組輪狀病毒混合感染檢出6 份，檢出率1.61%，均為人員標本，其中A組輪狀病毒和NV(基因組GⅠ/GⅡ)1份，A組輪狀病毒和GⅠ型NV 為2 份，A 組輪狀病毒和GⅡ型NV 為3份。144份NV 陽性標本中，檢出GⅡ型NV為111 份，構成比77.08%，GI 型NV 為22 份，構成比15.28%；檢出NV(基因組GⅠ/GⅡ)11 份，構成比7.64%。檢測結果顯示，A 組輪狀病毒、NV 的S 型擴增曲線典型，陽性對照在三個通道均有S 型擴增曲線，空白和陰性對照沒有熒光信號產生，表明本試驗結果準確有效。

NV 感染者性別分布情況：不同性別間NV 感染陽性率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 NV感染者性別分布情況[n(%)]

NV 感染者職業分布情況：不同職業間NV 感染陽性率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 NV感染者職業分布情況[n(%)]

不同年齡組NV 陽性率比較：＞45 歲組人群諾如病毒感染陽性率最高，26～35歲組陽性率最低，不同年齡組人群陽性率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同年齡組NV陽性率比較[n(%)]

討 論

全球急性胃腸炎的散發病例和暴發疫情的主要致病原是NV，該病毒由于感染劑量低、抵抗力強、傳播速度快，極易造成大規模群體感染事件，NV 不僅可引起成人、兒童胃腸炎散發病例，還常在醫院、養老院、學校及托幼機構等場所引起暴發。NV 傳播途徑包括人傳人、經食物和經水傳播。人傳人可通過糞口途徑(包括攝入糞便或嘔吐物產生的氣溶膠)或間接接觸被排泄物污染的環境而傳播。食源性傳播是通過食用被NV 污染的食物進行傳播，污染環節可出現在感染NV 的餐飲從業人員在備餐和供餐中污染食物，也可出現食物在生產、運輸和分發過程中被含有NV的人類排泄物或其他物質所污染，例如食物暴露引起的點源暴發常會導致在一個機構或社區內出現續發的人與人之間傳播。2013年以來我國NV 感染導致的暴發疫情大幅增加，主要發生在學校、托幼機構和醫療機構等人群聚集場所[3]。本探討的聚集性疫情發生在學校，通過檢測各類標本373份，檢出人員標本NV 陽性131 份，檢出率35.12%，高于部分地區的檢出率[4-5]；檢出人員標本A 組輪狀病毒陽性2 份，A 組輪狀病毒檢出率為0.54%，明顯低于NV 檢出率；檢出A 組輪狀病毒和NV 均為陽性標本6 份，檢出率為1.61%。我國國內多地監測結果也顯示，GⅡ型是NV感染的主要基因型。麗水、寧波、沈陽通過對NV腹瀉病例分析，G Ⅱ型的檢出率分別為92.12%、93.4%、86.96%，本次探討的疫情中仍以G Ⅱ型(77.08%)感染為主，GⅠ型占15.28%，與上述地區監測結果一致[6]。該疫情中NV 感染病例性別分布比較，男性陽性率51.55%，女性陽性率50.31%，不同性別感染陽性率比較，差異無統計學意義，與相關文獻結果一致[7]。也有較多文獻支持NV 感染的不同年齡比較，差異有統計學意義[8]。經過對本起疫情的流行病學調查，分析傳染源為該學校食堂的一名54 歲從業人員，＞45 歲組人群主要是學校食堂及其他后勤部門工作人員，與他有密切接觸，因此，陽性率最高；16～25 歲組人群以住校學生為主，多在該食堂就餐，造成陽性率也較高；26～35 歲組人群多為年輕的教職工，該組人群在外面餐館就餐或點外賣人數較多，在學校食堂進餐人數與次數均較少，因此，被傳染的機會降低，陽性率在各年齡組中最低。

該探討采用三重實時熒光PCR 方法，運用熒光標志物和自動化儀器，依據每一個反應體系均含有輪狀病毒、GⅠ型、GⅡ型NV基因保守序列設計的特異性引物和探針，在同一反應管內實現了對三種病毒的同時檢測和分型，并在幾個小時內完成檢測，縮短了檢測時間和流程，提高了檢測效率。

綜上所述，NV 可能是導致本次疫情的主要病原體，同時存在NV 和A 組輪狀病毒混合感染的情況，三重實時熒光PCR 法同時檢測多種病毒為疫情快速處置提供了實驗室依據。