彌漫大B細胞淋巴瘤患者神經生長因子、Netrin-1、腦源性神經生長因子的表達及相關性分析

林道銳 徐璐 陳瑜 郭麗娟 楊慧

彌漫大B細胞淋巴瘤是一種常見的好發于血液系統的惡性腫瘤[1]，是非霍奇金淋巴瘤的常見病理類型[2,3]。彌漫大B細胞淋巴瘤患者常見臨床癥狀有無痛性、進行性的淋巴結腫大，發熱，乏力，盜汗等[4]。彌漫大B細胞淋巴瘤最常見累及的部位為胃腸道，胃或者回盲部，其他的部位也常常有發生。該病多見于>60歲的老年人，也可以見于兒童[5]。靶向治療是近幾年興起的淋巴瘤治療手段，患者的化療效果較為可觀，且不良反應發生率相對較低，完全緩解率可以達到75%～80%，5年的生存率大約為50%，但每種靶向藥物只針對特定的患者群體，在治療上產生了局限性，所以發掘新型治療靶點刻不容緩[6]。神經因子在惡性腫瘤的發生和發展過程中扮演著重要角色[7]，神經生長因子在膽管癌和骨腫瘤等惡性腫瘤組織中的表達顯著升高，抗神經因子治療能夠有效緩解患者臨床癥狀、促進癌細胞的凋亡，抗神經生長因子信號通路維持著霍奇金淋巴瘤細胞的生存，神經生長因子沉默的霍奇金淋巴瘤細胞凋亡比例顯著升高。Netrin-1 是Netrin 家族成員之一，在神經生長、血管生成和免疫反應中均發揮著強大的調控功能[8,9]。腦源性神經生長因子主要位于中樞神經系統能夠維持神經元的存活和生長[10]，并在一些惡性腫瘤的增殖和侵襲中發揮著促進作用。本文通過觀察神經生長因子、Netrin-1、腦源性神經生長因子在彌漫大B細胞淋巴瘤患者組織的變化，并分析其關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2020年12月來我院就診的符合診斷標準的彌漫大B細胞淋巴瘤患者60例為研究對象，根據淋巴瘤國際預后指數(IPI)將患者分成低危組(評分≤2)和高危組(評分>2)，每組30例患者；另采取30例慢性淋巴結炎患者活檢淋巴組織為對照組。本研究獲得醫院倫理委員會批準，經患者及其家屬同意。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①病理結果確診為彌漫大B細胞淋巴瘤；②年齡：16～60。

1.2.2 排除標準:①患有慢性阻塞性肺疾病；②伴隨癌癥；③患有退行性神經病變和自身免疫性疾病等慢性疾病患者; ④合并腦出血和腦梗死; ⑤合并結核、艾滋病和乙肝病毒感染患者; ⑥長期酗酒;⑦吸毒。

1.3 試劑盒材料 羊血清封閉液、生物素二抗、堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液、蘇木精; Ki-67、CD31、NGF、BDNF 和 Netrin-1 一抗; CD4-PE、CD25-FITC; 淋巴細胞分離液。

1.4 免疫組化法檢測Ki-67、神經生長因子、Netrin-1、腦源性神經生長因子的表達 收集淋巴標本，4%多聚甲醛固定24 h后，進行石蠟切片。梯度脫水后，加入3%過氧化氫。PBS清洗3次，羊血清封閉液封閉30 min后，滴加Ki-67、NGF、BDNF 和 Netrin-1的一抗，4℃冰箱過夜。緩沖液清洗3遍，加二抗，孵育。再沖洗3遍，加入工作液，孵育。PBS清洗3次后顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，脫水，透明，封片，之后置于顯微鏡下觀察。

1.5 流式細胞術檢測調節性 T 細胞比例 收集各組患者治療前的外周血3 ml，加入3 ml的0.9%氯化鈉溶液稀釋。加入淋巴細胞分離液上層，梯度離心。取中間的白膜層，0.9%氯化鈉溶液清洗3次后，平均分成3份，加入流式細胞學抗體(CD4-PE和CD25-FITC)，避光室溫條件下染色20 min。

2 結果

2.1 3組一般資料比較 3組研究對象一般資料在性別比、年齡、體重方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組研究對象一般資料比較

2.2 Ki-67增殖指數變化 低危組 Ki-67較對照組上升；高危組較低危組上升(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 Ki-67增殖指數變化(×100)

表2 Ki-67增殖指數變化

2.3 神經生長因子、Netrin-1、腦源性神經生長因子表達的變化：與對照組相比，低危組神經生長因子、Netrin-1平均光密度增加(P<0.05)；與低危組相比，高危組神經生長因子、Netrin-1平均光密度增加，差異有統計學意義(P<0.05)；3組腦源性神經生長因子平均光密度比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表3 神經生長因子、Netrin-1、腦源性神經生長因子表達的變化

圖2 神經生長因子、Netrin-1、腦源性神經生長因子表達的變化(免疫組化×100)

2.4 Treg細胞比例比較 與對照組比較，低危組Treg比例增加(P<0.05)；與低危組比較，高危組Treg比例增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 Treg細胞比例

表4 Treg細胞比例

2.5 相關性分析 神經生長因子與Ki-67、Treg呈正相關(r=0.968或0.859,P<0.01)；Netrin-1與Ki-67、Treg、神經生長因子呈正相關(r=0.964或0.825,P<0.01)；腦源性神經生長因子與Ki-67、Treg、神經生長因子沒有相關性(P>0.05)。見表5，圖4。

表5 相關性分析

圖4 相關性分析

3 討論

彌漫大B細胞淋巴瘤是發生在淋巴造血系統腫瘤的一種，嚴重影響機體的造血功能，具有較強的侵襲性與異質性，是發病率較高的惡性淋巴瘤[11,12]。化療是治療該病的主要方法[13]。彌漫大B細胞淋巴瘤為一種高度惡性、對化療相對敏感的淋巴瘤，骨髓抑制是化療的主要毒副作用之一，它包括貧血、白細胞較少、血小板減少，臨床患者多因化療不能耐受，尤其是老年患者，由于年齡高、體質差，易同時合并心、腦、腎疾病，不能按時、足療程完成治療，影響疾病預后。因此，尋找緩解臨床癥狀、改善生存質量、提高生活質量、穩定瘤體、提高機體免疫力、延緩腫瘤發展的治療方法是目前惡性淋巴瘤治療的重點。本文通過比較神經生長因子、Netrin-1、腦源性神經生長因子在彌漫大B細胞淋巴瘤患者體內的表達變化并分析其相關性。

相關研究表明，神經生長調節分子能夠維持神經正常功能、促進神經損傷修復，還能夠調節免疫、細胞保護和促血管生成[14,15]。但腫瘤細胞中神經生長調節分子高表達的機制尚不明確，有猜測稱其作用機制可能與腫瘤細胞浸潤神經引起神經生長因子及Netrin-1表達增加、腫瘤自身分泌以及腫瘤微環境等有關。現有研究發現，神經生長調節分子能夠促進腫瘤的發生和發展。TrkA、p75均是神經生長因子的受體，高表達的神經生長因子和TrkA可以增加癌細胞的侵襲率，且其表達與腫瘤的淋巴結轉移、遠距離播散、高TNM分期、低分化和低存活率緊密相關[16,17]。本文通過實驗發現，彌漫大B淋巴瘤患者組織中神經生長因子的表達明顯增加，并且其與癌細胞增殖指數Ki-67具有顯著相關性，這提示，我們可以在臨床上將神經生長因子作為評估彌漫大B細胞淋巴瘤的分級及預后的指標。另外，神經生長因子還與PI3K/AKT、mTOR等信號通路有密切聯系[18]，這些通路都或多或少的與腫瘤細胞的免疫、生物學功能及為環境有關，所以深入挖掘神經生長因子對惡性腫瘤的作用效果及調控機制，對其應用于淋巴瘤的靶向治療中具有重要臨床意義。

Netrin-1是一種軸突導向分子，也是新型的免疫抑制因子，能夠促進神經末梢定向生長、顯著降低患者的抗腫瘤免疫能力。研究發現，Netrin-1參與多種惡性腫瘤的發生發展，能促使腫瘤細胞增殖、凋亡和促進血管生成等[19]。本文通過實驗發現，彌漫大B細胞淋巴瘤患者組織中Netrin-1呈現高表達，并且其與癌細胞增殖指數Ki-67具有顯著相關性，這指示Netrin-1與淋巴瘤的發生和發展密切相關，可將其當做另一個重要靶點應用于彌漫大B細胞淋巴瘤的精準治療。Treg 細胞是哺乳動物體內重要的免疫抑制細胞，具有強大的抑制細胞免疫和固有免疫反應的功能。本文實驗發現，患者外周血Treg細胞顯著高表達，且與神經生長因子、Netrin-1呈現正相關性，其具體作用機制尚不清楚。腦源性神經生長因子是中樞神經系統內的神經營養因子，在腫瘤細胞的增殖遷移中具有重要作用，所以被廣泛應用于抗腫瘤治療[20]。但本文實驗結果表明，其在該病中的變化并不顯著，所以其應用于該病的靶向治療效果可能不是很好。

綜上所述，彌漫大B細胞淋巴瘤患者組織中神經生長因子和Netrin-1顯著高表達，并且與增殖指數Ki-67密切相關，神經生長因子、Netrin-1與外周血Treg細胞比例顯著正相關，這為彌漫大B細胞淋巴瘤患者的靶向檢測治療提供了新靶點，其作用機制尚不明確，還需進一步研究。