TGF-β1、MMP-9、VEGF在輸卵管妊娠中的表達和意義

金力榮，楊麥青，徐洪波，魏燕妮

（1.昌邑市人民醫院產科，山東 昌邑 261300；2.昌邑市人民醫院病理科，山東 昌邑 261300；3.濰坊市人民醫院病理科，山東 濰坊 261041；4.昌邑市人民醫院輸血科，山東 昌邑 261300；5.濰坊護理職業學院健康管理系，山東 濰坊 261041）

輸卵管妊娠（tubal pregnancy）是異位妊娠中最常見的一種，是婦產科最為常見的急腹癥[1]。輸卵管妊娠在早期未破裂時，診斷難度較大，若不經及時早期的診斷和治療，嚴重者會因失血致死[2，3]。現階段診斷異位妊娠的方法是通過一系列彩超和持續監測血清β-hCG 的水平，但這些指標都不具有特異性，因此探索新的特異性的標記物用以早期、及時診斷輸卵管妊娠具有重要意義。正常妊娠是一個非常復雜的過程，滋養葉細胞的受控侵襲、免疫細胞和細胞因子的平衡以及滋養葉細胞和免疫細胞之間的影響都起著重要的作用。TGF-β1 位于人染色體19q13.1-q13.3，是一種多功能細胞因子，可以調節免疫細胞生長、分化，影響細胞外基質的形成，維持免疫功能和免疫穩態，促進胚胎發育等[4-7]。以往研究表明[8，9]，TGF-β1 參與調解妊娠過程中母體免疫耐受的過程。TGF-β1 水平的改變參與了妊娠期相關疾病的發生發展，如自然流產、胎盤植入[10，11]。正常的血供和氧供對于維持正常的妊娠也是必不可少的。VEGF 在促進血管生成、調節細胞耐受低氧水平的過程中意義重大[12-14]。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一組蛋白水解酶，能夠降解細胞外基質，MMPs 在妊娠過程中可以水解細胞外基質，從而調節滋養葉細胞的浸潤功能[15-17]。本實驗綜合以上研究結論，通過研究TGF-β1、MMP-9、VEGF 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中的表達水平，及其與臨床指標的關系，以期明確TGF-β1、MMP-9、VEGF 在輸卵管妊娠發生發展過程中可能的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月-2020 年12 月于昌邑市人民醫院婦產科就診并經過臨床診斷且手術治療的輸卵管妊娠患者40 例作為觀察組，所有患者術前未經任何治療，臨床和病理資料保存相對完整，另選取同期非意愿妊娠正常早孕自愿行人工流產患者40 例作為對照組。兩組年齡、停經天數、孕次、體質指數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究已經醫院倫理委員會審批通過，所有研究對象均知情并簽署同意書。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

1.2 納入和排除標準 納入標準：①所有患者術前由2 名婦產科醫師結合彩超明確診斷；②均為自然受孕；③個人資料完整；④血常規、凝血功能正常；⑤血糖、血壓正常。排除標準：①認知、精神功能障礙；②合并遺傳疾病；③合并惡性腫瘤。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 經手術切除的輸卵管妊娠標本放入10%的中性福爾馬林固定12 h，經人工流產術后的新鮮絨毛組織用0.9%氯化鈉注射液沖洗去掉過多的血凝塊，然后用10%的中性福爾馬林固定12 h。常規取材后經脫水、透明行HE 染色。

1.3.2 免疫組織化學染色 TGF-β1、MMP-9、VEGF兔抗人單克隆抗體（工作液濃度1∶100）購買于武漢三鷹生物科技有限公司。所有絨毛組織標本均經2位病理醫師獨立診斷。取3～4 μm 切片，免疫組織組織化學方法采用SP 法，具體步驟包括：烤箱烤片、脫蠟、脫水；檸檬酸修復，羊血清孵育；滴加一抗（TGF-β1、MMP-9、VEGF）；滴加生物素標記的二抗抗體；加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶；滴加DAB 顯色液觀察顯色。染色滴加一抗時用PBS 液替代一抗當做陰性對照。

1.4 結果判讀 依據美國臨床腫瘤學會ASCO 分級分別對TGF-β1、MMP-9、VEGF 的染色進行判讀。染色陽性的細胞面積＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，依次記為0、1、2、3、4 分。細胞著色強度標記-、+、++、+++，依次記為0、1、2、3 分。將染色陽性的細胞面積評分和細胞著色強度評分相乘，＜4 分為低表達，≥4 分為高表達。

1.5 觀察指標 比較兩組絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達水平，分析觀察組絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 表達與臨床指標的關系，探討TGF-β1與MMP-9、VEGF 的關系。

1.6 統計學處理 采用統計分析軟件SPSS 19.0 對本實驗數據進行分析。計量資料以（±s）表示，組間比較行t檢驗；計數資料以[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；相關關系采用Pearson 相關性分析；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組TGF-β1、MMP-9、VEGF 表達比較 觀察組TGF-β1、VEGF 蛋白表達低于對照組，MMP-9蛋白表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組TGF-β1、MMP-9、VEGF 表達比較[n（%）]

2.2 觀察組TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達與臨床指標的關系 觀察組絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達水平與年齡、停經天數、孕次、體質指數無關（P＞0.05），見表3。

表3 觀察組TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達與臨床指標的關系

2.3 觀察組TGF-β1 的表達與MMP-9、VEGF 表達的關系 觀察組TGF-β1 的表達與VEGF 呈正相關（r=0.326，P＜0.05），與MMP-9 的表達呈負相關（r=-0.353，P＜0.05），見表4、圖1。

圖1 TGF-β1 與VEGF、MMP-9 的相關性

表4 觀察組TGF-β1 表達與MMP-9、VEGF 表達的關系

3 討論

輸卵管妊娠是最常見的異位妊娠，以壺腹部妊娠最多見[3，18]。輸卵管妊娠未破裂時，臨床癥狀不典型，較難診斷，若不及時診斷和早期治療，嚴重者可危及生命。目前臨床采用輸卵管切除術和/或保守治療，手術切除會影響患者的再次妊娠，保守治療可能會再次導致輸卵管妊娠[19，20]。各治療效果都存在差異，因此探索新的用于指導診斷和治療的生物標志物對于改善患者預后意義重大。

在胚胎植入過程中，胚囊和子宮內膜的同步增殖和發育是建立妊娠的重要因素。成功的植入過程還需要調節母體對胚胎的免疫系統，增加植入部位的血管生成，以及基質細胞的蛻膜化，滋養葉細胞的受控侵襲等。一些生長因子/細胞因子及其受體的增加意味著這些因子在植入調節中的關鍵作用。這一過程中可能涉及的因素之一是TGF-β[21，22]。TGF-β1是TGF-β 亞型中最具代表性的一種，在對促進血管的形成、調節細胞增殖分化、調節免疫穩態等有重要作用[9-11]。TGF-β1 在早期自然流產和胎盤植入等妊娠相關疾病中出現異常表達[10，11]，說明TGF-β1 在正常妊娠過程中起著一定的作用。本研究發現，在輸卵管妊娠患者絨毛組織中TGF-β1 的表達減少，且TGF-β1 的表達與年齡、停經天數、孕次、體質指數一般臨床指標無關，提示TGF-β1 參與影響輸卵管妊娠的形成。

VEGF 是調節血管生成的主要因子之一。VEGF參與調控多種基因的表達，進一步促進內皮細胞增殖、促進新生血管形成、增加血管通透性[12-14]。VEGF在稽留流產患者血清中表達降低，在早期妊娠中表達降低會影響滋養葉細胞的侵襲和遷移，從而影響妊娠的正常發生[23]。有研究指出[24]，VEGF 在輸卵管妊娠患者血清中異常增多，可以用于輸卵管妊娠的診斷。本研究發現，VEGF 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中減少，與前述研究結果不同，可能是實驗方法和選取的實驗對象不同。說明VEGF 表達異常參與了輸卵管妊娠的發展過程，同時，TGF-β1 與VEGF 在輸卵管妊娠絨毛中的表達呈正相關，說明TGF-β1的表達與VEGF 的表達的變化有關，TGF-β1 對輸卵管妊娠的影響可能與VEGF 參與的血管形成過程有關。

MMPs 是鋅依賴性內肽酶家族，其中MMP-9起關鍵作用，MMP-9 的活化能夠促進細胞外基質的降解，有助于提高妊娠過程中滋養葉細胞的侵襲功能[15，16]。TGF-β1、MMP-9 的異常表達與重度子癇的發展有關。本研究發現，MMP-9 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中增多，說明滋養葉細胞的局部侵襲能力增強，并且TGF-β1 在輸卵管妊娠絨毛組織中的表達與MMP-9 的表達呈負相關，TGF-β1 對輸卵管妊娠的影響與MMP-9 有關，其與MMP-9 的作用是相反的。

綜上所述，TGF-β1 與VEGF 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中的表達減少，而MMP-9 的表達升高；TGF-β1 的表達與VEGF 的表達呈正相關，與MMP-9 的表達呈負相關；絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 蛋白表達異常可能參與了輸卵管妊娠的發生。