離體小鼠股骨骨小梁與骨皮質CT樣品制備探索

王戰京，武文琦，趙媛媛，雷建鋒

（首都醫科大學中心實驗室，北京 100069）

小動物活體分子影像學是近些年來新興的交叉學科，其使用影像手段顯示組織水平、細胞和亞細胞水平的特定分子，進而了解活體動物體內的相關生理變化[1-3]。顯微CT（Mirco-CT）是小動物活體分子顯像影像學重要的實驗方法，它適用于研究對象為小型嚙齒類動物（小鼠，大鼠等），可無創、定量、多次重復的提供小動物骨組織與肺組織結構學變化[4，5]。同時它還是對離體小動物骨組織進行骨密度、骨小梁測量的重要手段[6-8]。小動物CT 對骨密度進行測算的原理是通過測量X 射線衰減系數（AC）與該材料的質量密度的相關性進行配準計算，從而得出實驗樣品的密度。本次實驗主要探索不同的樣品制備方法對離體小鼠股骨骨小梁密度（BMD）和骨皮質密度（TMD）CT 定量測量的影響，為小動物離體樣品制備和CT 掃描提供選擇依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8 周雌性BALA/C 小鼠20 只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。取出40 根小鼠股骨浸泡于戊二醛溶液1 周，股骨重量0.13～0.8 g，長度5.3～4.8 cm。實驗中對動物的處置符合動物倫理學研究準則。

1.2 儀器設備和軟件 儀器設備為BRUKER 公司in-vivo X-ray Microtomograph SkyScan-1276，由首都醫科大學中心實驗室提供，掃描系統為SKSCAN-1276 SYSTEM OVERVIEW，重建系統為SkyScan NRecon，2D 圖像觀察與校正軟件為SkyScan DataViewer，3D 圖像展示軟件為SkyScan Volume Rendering，圖像分析軟件為SkyScan 2D/3D Image Analysis。

1.3 分組及方法 采用隨機數字表法將40 根小鼠股骨分為無水合制備組和水合制備組，每組20 根。按照不同的方法制備實驗樣品，然后在相同條件下對樣品采用相同掃描參數進行掃描。無水合制備組于掃描當天直接從戊二醛溶液中取出離體小鼠股骨，掃描過程中采用直接暴露在空氣中。水合制備組于掃描前1 d 將固定于戊二醛溶液中的離體小鼠股骨放入EP 管中，加入純凈水進行12 h 水合，掃描過程中內部采用濕潤紙巾包裹，外邊再包保鮮膜，模擬小鼠股骨在活體的環境下進行Micro-CT 掃描。

1.4 圖像采集與骨密度計算 將標本水平固定于樣品床上，使標本與樣品床旋轉中心保持一致。選擇的掃描參數：矩陣2048×2048×116，電壓57 kV，電流72 μA，圖像分辨率5 μm/piex，曝光時間1300 ms,旋轉步長0.4 度，濾光片選擇厚度為0.25 mm 的Al，旋轉度數為206°，掃描時間22 min。掃描完成后，再用布魯克公司提供的密度標準樣品羥基磷灰石（CaHA）密封分別為0.25 g/cm3和0.75 g/cm3進行相同條件下CT 掃描[9-11]。掃描結束后分別對標準樣品與股骨頭使用SkyScan NRecon 進行相同參數的樣品重建，參數設置為平滑度為3，射線硬度設為60%。重建完成后使用SkyScan DataViewer 對標準樣與小鼠股骨進行物理位置的校正，校正結果為樣品在圖像中心，見圖1；樣品擺放整齊以便于下一步對其進行分析，圖像調整完畢后劃出感興趣區域（VOI）在對圖像進一步進行重建，使在不損失圖像質量的前提下，去除空白的像素區域，讓文件變小以便于后期處理，見圖2。圖像預處理結束后，使用SkyScan 2D/3D Image Analysis 對分析部位制作3D 重構圖。BMD：起始位置從縱切面距離生長板遠端1.5 mm 處開始向下取3.00 mm；TMD：起始位置從縱切面距離生長板遠端6 mm 處腔內沒有骨小梁分布處開始向下取3.00 mm。選取小梁內部區域與骨皮質外部區域同時進行重組獲得3D 圖像，圖像信息設為最低閾值[12-14]。使用SkyScan Volume Rendering 軟件對重建的3D 圖像進行展示。對骨組織重組的圖像使用SkyScan 2D/3D Image Analysis進行定量分析，可以得到BMD 值和TMD 值。首先測量標準樣品的射線吸收率，建立骨密度計算公式，再將需要測量的骨組織的射線吸收率代入公式計算出相應的骨密度。

圖1 SkyScan DataViewer 對標準樣和小鼠股骨進行物理位置校正

圖2 重建感興趣區域

1.5 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 17.0 進行數據分析，計量資料采用（±s）表示，使用配對t檢驗，置信區間設為95%。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨小梁與骨皮質3D 重建結果 使用SkyScan Volume Rendering 軟件展示重建的3D 圖像，見圖3。

圖3 3D 骨小梁結構和3D 骨皮質內部結構

2.2 兩組BMD 檢測結果比較 水合制備組BMD 檢測結果高于無水合制備組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1～表3。

表1 兩組BMD 檢測結果

表2 兩組BMD 檢測結果描述統計量

表3 兩組BMD 成對差分檢測結果t 檢驗結果

2.3 兩組TMD 檢測結果比較 兩組TMD 檢測結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4～表6。

表4 兩組TMD 檢測結果

表5 兩組TMD 檢測結果描述統計量

表6 兩組TMD 成對差分檢測結果t 檢驗結果

3 討論

小鼠是最常用的實驗動物之一，在骨科醫學、口腔醫學中常常用于各類疾損傷修復的研究。CT 對骨組織成像有獨特優勢，在臨床疾病診斷中有重要意義，是目前最為廣泛的檢測項目之一[15-18]。Mirco-CT作為骨組織形態計量學的重要檢測手段具有不可替代性，尤其是對BMD 和TMD 的測量具有突出優勢。精度可以達到微米級別，能夠清晰的分辨骨小梁結構，精準測算出骨小梁與骨皮質的密度等相關數據，再配合三維重構軟件、幾何測量軟件，可以對各類硬組織進行精準觀測。動物離體骨具有便于保存，有助于各類實驗順利展開，在醫學科研領域研究使用十分廣泛[18]。而離體骨的檢測與活體骨組織檢測由于存在環境不同，實驗結果存在一定的差異。如何讓保存的離體骨的測量結果更加接近與真實的活體檢驗結果，一直是實驗員探討的課題之一。同時在不影響掃描結果的前提下，如何短時間測量打樣品量也是實驗室科學探索方向之一。

本次研究顯示，水合制備組BMD 檢測結果高于無水合制備組，差異有統計學意義（P＜0.05）；說明兩種制備方法樣品對CT 掃描結果存在差異。由于顯微CT 掃描測試是小動物骨小梁BMP 分析的金標準，其中骨小梁密度作為重要參數之一，測量結果直接影響的實驗結果的準確性。通過結果可以看出水合后CT 掃描結果密度增加，更加接近與動物體內真實數值；同時觀察骨小梁結構狀態無明顯變化。本次研究中，兩組TMD 檢測結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明兩種制備方法樣品對CT 掃描結果存在差異不明顯。TMD 作為CT 掃描重要參數之一，測量結果直接影響實驗結果的準確性。無水合與水合后CT 掃描結果密度無明顯差異，說明骨皮質密度高，水分子很難滲透到骨皮質之中，無水合不影響CT 掃描結果。

Mirco-CT 是骨密度檢測的金標準，它的結果可衡量前期實驗動物模型建立是否成功，同時對下一步動物實驗的修復治療提供重要參考依據。因此，建議使用水合制備法以使實驗結果更加準確。需要說明的是，本次研究實驗的數量相對較少，并且采用單一的小鼠股骨，沒有對大鼠以及裸鼠進行比較，研究使用的儀器也比較單一。今后需要更多的相關研究確保其有效性、實用性，從而為臨床前實驗動物研究提供有力保障。

綜上所述，無水合制備法直接影響了BMD 的測量結果準確性，對TMD 的測量結果產生的影響較小，使用水合制備法更能保證實驗結果的準確性。