呂彥瑋 王麗娟 黃仁前 林曦 韓超 胡良皞 李兆申

海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200433

進展性胰腺纖維化為CP最主要的病理學特征。研究表明，胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells, PSCs)活化是胰腺組織纖維化初始階段的關鍵效應細胞[1]。胰腺急性損傷和炎癥發生后，靜息狀態的PSCs可被組織微環境中各種損傷相關刺激因子和促炎因子(如TGF-β、PDGF、TNF-α、IL-1β、IL-6等)激活，轉化為肌成纖維細胞樣細胞[2]，并分泌纖連蛋白(fibronectin, FN)及Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原等細胞外基質成分，參與組織修復；若PSCs活化過度則可造成細胞外基質的大量沉積，最終導致胰腺組織纖維化[3-4]。柚皮素為黃酮類化合物，在自然界中分布廣泛，具有抗炎、抗氧化、免疫調節等多種生物學功能[5]。對人急性單核細胞白血病細胞系THP-1的體外研究表明，柚皮素可通過抑制NF-κB信號通路活性從而抑制多種促炎因子的產生[6]；在膽固醇誘導的大鼠肝炎模型中，使用柚皮素可顯著減輕大鼠肝臟炎癥反應[7]。另有多項研究表明柚皮素在緩解多種組織器官的纖維化中也發揮重要作用。在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化模型中，柚皮素可通過抑制TGF-β/Smad3、JNK/Smad3等信號通路抑制肝星狀細胞活化，從而改善肝纖維化[8]；柚皮素與積雪草酸聯合應用可通過抑制TGF-β/Smad信號通路顯著改善腎纖維化[9]；此外，柚皮素對肺纖維化和肺癌轉移亦具有明顯抑制作用[10]。然而，目前尚無關于柚皮素在胰腺纖維化中作用的相關研究報道。本研究應用CP小鼠和PSCs進行相關實驗，旨在從體內和體外兩個方面綜合探討柚皮素在胰腺纖維化中可能發揮的作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

18只SPF級6周齡雄性C57BL/6小鼠購于上海靈暢生物科技有限公司，將其按數字表法隨機分為對照組、CP組和柚皮素干預組(柚皮素組)，每組6只。采用腹腔注射雨蛙素的方法構建CP模型，劑量為50 μg/kg，每天6次(兩次給藥間隔1 h)，每周一、三、五給藥，共6周；柚皮素組于造模后第4周的第1天開始予柚皮素灌胃。柚皮素用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶解，劑量為200 mg/kg，每天1次，直至處死小鼠的前一天；對照組和CP組予等容積CMC-Na灌胃。造模期間行最后一次雨蛙素注射5 d后使用水合氯醛注射麻醉小鼠，頸椎脫臼法處死，常規剖腹取胰腺組織，置于4%多聚甲醛中固定。

二、胰腺組織病理學檢查及膠原纖維沉積度檢測

取各組小鼠多聚甲醛固定的胰腺組織，石蠟包埋、切片，分別行蘇木精-伊紅染色及針對膠原纖維的天狼星紅染色，光學顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學變化，并參照改良Schmidt評價標準[11]進行胰腺組織病理評分：(1)炎癥細胞浸潤(無炎癥細胞浸潤為0分，炎癥細胞浸潤<5%、5%～<10%、10%～<50%、≥50%分別計1、2、3、4分)；(2)腺泡萎縮程度(無腺泡萎縮為0分，少量、中等量、大量或嚴重腺泡萎縮分別計1、2、3分)；(3)膠原纖維化程度(無纖維化為0分，局限性纖維化為2分，彌漫性纖維化為4分)。三項之和即為總分。膠原纖維沉積程度以膠原纖維陽性區域占單個視野全部區域的百分比來表示。所有數據均由隨機選擇各小鼠5張胰腺切片，每張胰腺切片隨機選擇6個視野進行觀察、計算得到。

三、PSCs培養及存活率檢測

人源性PSCs由美國德克薩斯大學MD安德森癌癥中心Craig D Logsdon教授贈予，使用含10%胎牛血清、1%雙抗和1∶20 000 De-plasma的高糖型DMEM培養液常規培養、傳代。

利用高敏CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒(江蘇凱基生物公司)檢測細胞活性。于96孔板中加入PSCs(1×104個細胞/孔，100 μl培養液)，于恒溫培養箱中培養24 h，加不同濃度(0、5、10、20、50、100、150、200 μmol/L)柚皮素進行干預，以單加DMSO的PSCs作為對照組，每組設置3個復孔，繼續培養24 h，再加入CCK-8試劑，10 μl/孔，分別避光繼續孵育1、2、3、4 h，上酶標儀檢測450 nm處的吸光度值(A450值)，計算不同濃度柚皮素干預的細胞存活率。

四、PSCs活化、增殖與凋亡蛋白表達的檢測

使用直徑10 cm的培養皿培養PSCs，每個培養皿10 ml培養液，待細胞生長密度達到50%～70%時，用外源重組蛋白TGF-β1(2 ng/ml)單純刺激PSCs(TGF-β1刺激組)，以及TGF-β1(2 ng/ml)刺激1 h后分別加低(50 μmol/L)、中(100 μmol/L)、高濃度(150 μmol/L)柚皮素干預PSCs，以單加DMSO的PSCs作為對照組。干預培養36 h后，離心收集細胞，加入適量RIPA裂解液，低溫下20 min內振蕩3～4次，充分裂解細胞，13 200 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取上清。采用BCA定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定總蛋白濃度。常規行蛋白質免疫印跡法檢測PSCs活化標志蛋白FN和Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(collagen type Ⅰ alpla 1, COL1A1)、細胞增殖標志物p21以及抗凋亡蛋白Bcl-xL和促凋亡蛋白Bax、Bid的表達，以GAPDH或β-actin作為內參。抗β-actin、GAPDH抗體購自武漢Engibody Biotechnology公司；Anti-FN抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；抗COL1A1、p21、Bcl-xL、Bax、Bid抗體均購自美國Cell Signal Technology公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體、HRP標記山羊抗兔IgG抗體購自上海雅酶生物公司。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。實驗至少重復3次。應用Image J軟件分析掃描圖像，以目的條帶與內參條帶的灰度值比為蛋白相對表達量。

五、統計學處理

結 果

一、各組小鼠胰腺病理學改變和膠原纖維沉積程度比較

對照組小鼠胰腺組織結構完整，腺泡排列緊致，未見腺泡萎縮、腺泡導管組織轉化；CP組小鼠胰腺組織出現明顯腺泡萎縮、腺泡導管組織轉化和炎癥細胞浸潤等CP特征性病理學改變；柚皮素組小鼠胰腺組織病理改變較CP組明顯改善，腺泡形態恢復至較完整狀態，腺泡排列更為緊致(圖1)。對照組、CP組、柚皮素組小鼠胰腺組織病理評分分別為0、(7.33±1.15)、(4.67±1.15)分，CP組顯著高于對照組，柚皮素組顯著低于CP組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，提示CP模型誘導成功，而柚皮素可顯著緩解CP小鼠的胰腺組織病理損傷。

圖1 對照組(1A)、慢性胰腺炎組(1B)和柚皮素組(1C)小鼠胰腺組織病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×100)

對照組小鼠胰腺組織未見膠原纖維沉積；CP組小鼠胰腺組織出現廣泛的膠原纖維沉積；而柚皮素組小鼠胰腺組織膠原纖維沉積顯著減少(圖2)。對照組、CP組、柚皮素組小鼠胰腺組織膠原纖維陽性區域占比分別為(4±2)%、(46±4)%、(28±2)%，CP組顯著高于對照組，柚皮素組顯著低于CP組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，提示柚皮素可明顯改善CP小鼠胰腺組織的纖維化程度。

圖2 對照組(2A)、慢性胰腺炎組(2B)和柚皮素組(2C)小鼠胰腺組織膠原纖維沉積(天狼星紅染色 ×100 )

二、不同濃度柚皮素干預后PSCs細胞存活率的變化

與對照組比較，5、10、20、50、100、150、200 μmol/L柚皮素干預PSCs 24 h后，僅200 μmol/L柚皮素干預組PSCs存活率降為83.0%，差異有統計學意義(P值<0.05)，而其他濃度柚皮素干預不影響PSCs存活率，故后續實驗選擇150 μmol/L作為柚皮素干預PSCs的最大藥物濃度。

三、各組PSCs活化相關蛋白表達水平比較

對照組，TGF-β1刺激組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預組PSCs的FN蛋白表達量分別為0.02、0.76、0.67、0.34、0.07，COL1A1蛋白表達量分別為0.51、1.71、1.34、0.84、0.11，TGF-β1刺激組顯著高于對照組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預組則呈濃度依賴性顯著低于TGF-β1刺激組，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖3)，提示TGF-β1刺激可促進FN及COL1A1蛋白表達，即促進PSCs的活化，而柚皮素干預可顯著抑制TGF-β1誘導的FN及COL1A1蛋白表達，即抑制PSCs的活化。

注：TGF-β1為轉化生長因子-β1；PSCs為胰腺星狀細胞圖3 對照組(1)，TGF-β1刺激組(2)，TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)濃度柚皮素干預組PSCs活化相關蛋白的表達

四、各組PSCs增殖標志物蛋白表達水平比較

對照組，TGF-β1刺激組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預組PSCs的p21蛋白表達量分別為0.87、1.18、1.27、1.22、1.00，TGF-β1刺激組顯著高于對照組，TGF-β1刺激后高濃度柚皮素干預組顯著低于TGF-β1刺激組，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖4)，而TGF-β1刺激后低、中濃度柚皮素干預組與TGF-β1刺激組差異無統計學意義(P>0.05)，提示TGF-β1刺激可促進PSCs增殖，而高濃度柚皮素可顯著抑制TGF-β1誘導的PSCs增殖。

注：TGF-β1為轉化生長因子-β1；PSCs為胰腺星狀細胞圖4 對照組(1)、TGF-β1刺激組(2)、TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)濃度柚皮素干預組PSCs增殖相關蛋白表達

五、各組PSCs凋亡標志物蛋白表達水平比較

對照組，TGF-β1刺激組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預組Bcl-xL蛋白表達量分別為2.09、2.21、2.38、2.50、2.12，Bax蛋白表達量分別為0.98、0.88、0.98、1.00、0.88，Bid蛋白表達量分別為1.15、1.09、1.14、1.18、1.18，各組之間的差異均無統計學意義(P值均>0.05，圖5)，提示TGF-β1刺激和柚皮素干預對PSCs凋亡均無明顯影響。

注：TGF-β1為轉化生長因子-β1；PSCs為胰腺星狀細胞圖5 對照組(1)、TGF-β1刺激組(2)、TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)濃度柚皮素干預組PSCs凋亡相關蛋白表達

討 論

在各種因素導致的胰腺急性損傷和炎癥狀態下，PSCs由于各種因子的刺激而活化，可分泌大量促細胞增殖和促纖維化因子，改變胰腺微環境，并分泌多種膠原纖維類蛋白和金屬蛋白酶及其抑制劑等參與細胞外基質降解與重構，最終促進胰腺纖維化進程[12]。由此可見，PSCs的活化是胰腺纖維化的核心環節，因此抑制PSCs的活化是緩解胰腺纖維化的重要途徑。

TGF-β1作為組織纖維化的關鍵性調節因子，可通過激活其下游Smad轉錄因子促進PSCs活化、增殖，活化的PSCs分泌大量FN和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原等重要細胞外基質成分，參與多種組織器官纖維化進程[13-15]，故本研究中使用TGF-β1刺激PSCs活化，模擬其在胰腺纖維化中的活性改變，隨后使用不同濃度的柚皮素對細胞進行干預。結果顯示，柚皮素可顯著改善CP小鼠胰腺組織的炎癥、萎縮和纖維化程度，緩解雨蛙素所致胰腺損傷；體外細胞實驗結果顯示，TGF-β1可促進細胞外基質重要成分FN和COL1A1及細胞增殖標志物p21的蛋白表達，即可促進PSCs的活化和增殖，而柚皮素可顯著抑制上述蛋白的表達，表明柚皮素對PSCs的活化和增殖具有抑制作用。此外，TGF-β1刺激和柚皮素處理均對PSCs的凋亡無明顯影響。

柚皮素是一種具有抗腫瘤、抗衰老、調節脂肪代謝等多種生物學功能的黃酮類化合物[16]。已有體內外研究表明，柚皮素可通過FKBP4/NR3C1/NRF2信號通路抑制人乳腺癌細胞的自噬和增殖過程[17]。本研究中柚皮素對PSCs的活化和增殖過程發揮抑制作用與上述研究結果一致。結合前文所述PSCs在炎癥反應、組織創傷修復以及纖維化相關生理、病理過程中的重要調控作用，筆者推測柚皮素可通過抑制PSCs活化和增殖，減少FN和I型膠原等細胞外基質重要成分的表達，從而緩解胰腺組織纖維化，對CP的胰腺纖維化可能具有潛在的治療價值。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明呂彥瑋：實驗操作、論文撰寫；黃仁前、林曦、韓超：數據整理、統計學分析；王麗娟、胡良皞、李兆申：研究指導、論文修改、經費支持