植物乳桿菌在不同品種葡萄酒中蘋果酸乳酸發酵性能的評價

陸文軒，張碧穎，巴旦加布，石侃,2,3,4,5*，劉樹文,2,3,4,5*

1(西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌，712100)2(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌，712100) 3(國家林業和草原局葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌，712100)4(西北農林科技大學, 合陽葡萄試驗示范站， 陜西 渭南，715300)5(西北農林科技大學, 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗站，寧夏 永寧，750104)

葡萄酒中的蘋果酸乳酸發酵(malolactic fermentation, MLF)是經過酒精發酵(alcohol fermentation， AF)之后由乳酸菌主導的發酵過程，也叫做二次發酵[1]。在蘋果酸乳酸發酵過程中，乳酸菌在蘋果酸乳酸酶的作用下，以L-蘋果酸為底物，生成L-乳酸和二氧化碳[2]。自發的蘋果酸乳酸發酵通常是不可控制的，而且葡萄酒中嚴苛的環境如低pH、高酒精濃度、高SO2濃度和低溫會阻礙乳酸菌生長，最終導致發酵被迫中止[3]。目前可啟動蘋果酸-乳酸發酵的乳酸菌有片球菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬和乳桿菌屬4個屬，其中酒球菌屬的酒類酒球菌(Oenococcusoeni)和乳桿菌屬的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)能夠克服嚴苛的葡萄酒環境，被廣泛應用于食品科學技術和發酵產品中[4]。目前，國內葡萄酒市場使用最廣泛的蘋果酸乳酸發酵劑是酒酒球菌，但是酒酒球菌發酵存在發酵時間長，能耗高的問題，且低pH、營養不足、高濃度乙醇等都能抑制菌的生長。只有在酒酒球菌濃度>1×108CFU/mL，且在亞致死的酒精濃度下馴化時，才能啟動并完成蘋果酸乳酸發酵[5]；而植物乳桿菌能在低pH條件下很好地發揮功能，對乙醇的耐受性高達14%，具有與酒酒球菌相似的耐受性，并且具有更多樣化的酶活性，可以產生更多的芳香化合物，都有助于植物乳桿菌成為最新一代的葡萄酒蘋果酸乳酸發酵劑。許多學者對植物乳桿菌的應用價值進行了詳細研究，有學者從果酒中分離出優良的乳桿菌菌株，并將其應用于櫻桃酒[6]、獼猴桃酒[7]、葡萄酒[8]的釀造與發酵，也有學者將乳清液作用于復配生產冷凍干燥植物乳桿菌發酵劑[9]。然而我國由于優良菌株和技術的缺失，目前仍大量依靠國外的商業發酵劑，難以展現我國本土的風土特性[10]。本研究選用實驗室保藏的3株植物乳桿菌，研究了其在不同品種葡萄酒的蘋果酸乳酸發酵過程菌密度的變化，對蘋果酸降解率、糖代謝、花色苷和顏色等方面進行綜合評價，旨在篩選出能夠高效完成蘋果酸乳酸發酵的植物乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株與培養基

植物乳桿菌XJ-25、XJ-14、XJA-2，分離自新疆赤霞珠葡萄酒中。所用菌株均采用MRS固體培養基劃線培養，在37 ℃條件下培養7 h。

MRS液體培養基(g/L)：葡萄糖 20，牛肉膏 10，蛋白胨 10，酵母膏 5，醋酸鈉 5，Tween-80 1 mL/L，醋酸氫二鉀 2，檸檬酸氫二銨 2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，半胱氨酸 0.5。

MRS固體培養基：液體培養基成分中添加15 g/L瓊脂粉。

MLO-Ⅰ液體培養基(預適應培養基)(g/L)：MRS 50，D-果糖 40，D-葡萄糖 20，L-蘋果酸 4，Tween-80 1，維生素B60.1 mg/L，用1 mol/L HCl溶液調整pH為4.6，乙醇5%(體積分數)。

MLO-Ⅱ液體培養基(預適應培養基)：在MLO-Ⅰ液體培養基的基礎上, 用1 mol/L HCl溶液調整pH為3.5，乙醇10%(體積分數)。

1.1.2 供試酒樣

供試酒樣為酒精發酵結束(未啟動蘋果酸乳酸發酵，未添加SO2)的寧夏賀蘭山東麓銀川產區2019年耘嶺酒莊酒赤霞珠葡萄酒，2019年九月蘭山酒莊西拉葡萄酒，2020年張裕摩塞爾十五世酒莊蛇龍珠葡萄酒和2020年陜西玉川美樂葡萄酒。試驗酒樣的基本理化指標如表1所示。

表1 試驗酒樣基本理化指標Table 1 Basic physical and chemical parameters of wine samples

1.1.3 主要試劑、儀器與設備

標準品L-蘋果酸、L-乳酸(色譜純)，純度≥99.0%，美國Sigma公司；標準品葡萄糖、果糖(色譜純)，純度≥99.0%，Aladdin公司；MALOSTART?，法國LAFFORT公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、醋酸鈉、Tween-80、醋酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O，四川西隴化工有限公司；L-蘋果酸、D-葡萄糖、D-果糖、維生素B6，索萊寶有限公司。

UV-2450 紫外分光光度計、BL-220H型電子天平、AUX 220型電子天平，日本島津公司；HH-4 恒溫水浴鍋，上海森信試驗儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5417R1 離心機，德國Eppendorf公司；Milli-Q BiocelTM 超純水儀，美國Millipore公司；Agilent 1260 Infinity Ⅱ 液相色譜，安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化與轉接

將3株植物乳桿菌甘油管從-80 ℃冰箱中取出，以1%的接種量接入MRS液體培養基中，在37 ℃培養箱培養9 h，然后以1%的接種量轉接到新鮮MRS液體培養基中，培養6 h。

1.2.2 菌株的預適應培養

將3株植物乳桿菌分別以10%的接種量轉接入MLO-Ⅰ(pH=4.6，乙醇5%)培養基中，培養48 h。再以10%的接種量轉接入MLO-Ⅱ(pH=3.5，乙醇10%)培養基中，培養36 h。

1.2.3 蘋果酸乳酸發酵

酒精發酵結束后的原酒用0.22 μm有機濾膜在超凈工作臺中進行過濾，加入0.2 g/L MALOSTART?(滅活酵母)混勻，低溫(4 ℃)靜置2 h。取MLO-Ⅱ 培養基中菌液，8 000 r/min離心10 min，用50 mL生理鹽水洗滌，重復2次。330 mL厭氧瓶中裝有280 mL葡萄酒，以5%的接種量分別接入植物乳桿菌XJ-25，XJ-14，XJA-2，最終濃度為1×108CFU/mL，在21 ℃條件下用厭氧瓶培養。把未接種任何菌株的葡萄酒作為對照組。

1.2.4 基本理化指標

對酒度、總酸、揮發酸、游離SO2和總SO2的測定方法參照文獻[11]。

1.2.5 生物量測定

每隔24 h取樣，用質量分數為0.75%的生理鹽水連續稀釋，取100 μL涂布在含有100 mg/L放線菌酮的MRS-瓊脂培養基上，將平板在37 ℃下培養60 h后進行乳酸菌的計數。

1.2.6 有機酸和糖

每隔8 h取樣監測有機酸。將葡萄酒樣品用超純水稀釋5倍，用0.22 μm有機濾膜過濾后用于Agilent 1260 Infinity Ⅱ HPLC分析。標準品蘋果酸和乳酸配制質量濃度分別為1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01 g/L的系列標準溶液，0.22 μm水系濾膜過濾后用于HPLC測試。色譜條件：色譜柱為BioRad Aminex HPX 87-H (300 mm×7.8 mm)，流動相為5 mmol/L H2SO4溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為60 ℃，進樣量為20 μL，檢測波長210 nm。

發酵結束后取樣檢測還原糖、乙醇。標準品葡萄糖和果糖配制質量濃度分別為0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01 g/L的系列標準溶液，標準品乙醇配制質量濃度分別為2、1.5、1、0.5、0.1、0.05 g/L的系列標準溶液，用0.22 μm水系濾膜過濾后用于HPLC測試。葡萄酒樣品用超純水稀釋10倍，用0.22 μm有機濾膜過濾后用于HPLC分析。Agilent 1260 Infinity Ⅱ 折光示差檢測器，檢測器溫度40 ℃。色譜條件同有機酸相同，進樣量為20 μL。

1.2.7 花色苷測定方法

參考YANG等[12]的方法，采用HPLC進行分析。以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標準品，根據保留時間與最大吸收波長，確定花色苷種類，對樣品的花色苷進行定量分析。HPLC條件：色譜柱為Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相A為V(超純水)∶V(乙睛)∶V(甲酸)=8∶4∶1；流動相B為V(超純水)∶V(乙睛)∶V(甲酸)=4∶4∶1。洗脫程序為：0～45 min：0%～35% B；45～46 min：35%～100% B；46～50 min：100% B；50～51 min：100% ～0% B；51～55 min：0% B。進樣量為20 μL；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長520 nm。葡萄酒樣品用0.22 μm有機濾膜過濾后用于HPLC分析。

1.2.8 顏色參數CIELAB的測定

1.2.9 數據處理

采用SPSS 18.0對試驗數據進行差異性分析(analysis of variance，ANOVA)檢查各個結果的顯著性差異，組間多重比較采用Duncan法，P<0.05，差異顯著，P<0.01，差異極顯著。采用Origin 2021b作圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種葡萄酒中植物乳桿菌的生長量變化

本試驗中，植物乳桿菌在不同品種葡萄酒的蘋果酸乳酸發酵期間生物量的動態變化如圖1所示。

由圖1可知，3株植物乳桿菌經過適應性培養后接入4個不同品種的葡萄酒中，活菌數均保持在8 lgCFU/mL。在赤霞珠葡萄酒中，3株植物乳桿菌的活菌數均呈現出短暫的上升趨勢，然后快速下降，在120 h后緩慢下降。美樂葡萄酒中，XJ-25的活菌數在前64 h呈現快速下降的趨勢，而后上升再下降，120 h后穩定在6.8 lgCFU/mL。與卜瀟等[8]的研究相比，經過MLO適應性培養基預馴化的植物乳桿菌在葡萄酒中具有更高的存活率。PASSOS等[15]的研究表明，在添加2或10 mmol/L蘋果酸的培養基中，植物乳桿菌的生長速率提高且最大細胞產量增加。BRAVO-FERRADA等[16]表明植物乳桿菌經過含有體積分數為6%或10%乙醇的MLO(pH=4.6)培養基預馴化后，能夠顯著減少細胞膜損傷并提高菌株在高酒精度高酸度葡萄酒中的生存能力。同時，膜完整性是保證L-蘋果酸降解的關鍵因素。

a-赤霞珠葡萄酒；b-美樂葡萄酒；c-西拉葡萄酒；d-蛇龍珠葡萄酒圖1 不同品種葡萄酒蘋果酸乳酸發酵過程中植物乳桿菌的生長量動態變化Fig.1 Dynamic changes of biomass in different varieties of wines during malolactic fermentation by L.plantarum

2.2 植物乳桿菌發酵不同品種葡萄酒過程中蘋果酸-乳酸的動態變化

如圖2所示，在赤霞珠葡萄酒中，前64 h內，XJ-25消耗蘋果酸速率最快，72 h以后，3株菌都能完全消耗蘋果酸(<0.2 g/L)，蘋果酸含量由2.27 g/L下降至0.17 g/L左右。蘋果酸乳酸發酵期間蘋果酸含量與乳酸呈顯著負相關，乳酸生成速率與蘋果酸降解速率基本一致，72 h以后乳酸含量達到最大值2.09 g/L。在西拉葡萄酒中，XJ-14在前88 h內均保持較高的蘋果酸消耗速率，降至0.28 g/L；88 h后，XJA-2將蘋果酸降至1.26 g/L后保持不變。最終XJ-14和XJA-2生成乳酸的含量分別為2.83、2.3 g/L。在美樂葡萄酒中，144 h內蘋果酸均呈現緩慢降低的趨勢，XJ-14為降酸最快的菌株，將蘋果酸降至0.38 g/L；XJ-25與XJA-2降酸速率相似，在144 h內降低了72.63%。XJ-14的乳酸含量從0.42 g/L上升至1.82 g/L。在蛇龍珠葡萄酒中，3株菌在56 h內均能夠將蘋果酸消耗徹底，且3株菌消耗蘋果酸的速率和生成乳酸的速率基本一致；發酵結束時，乳酸終含量平均為2.03 g/L。

XJ-14對赤霞珠、西拉、美樂、蛇龍珠葡萄酒中的蘋果酸降解率分別達到90.67%、90.15%、84.35%、92.20%，能夠對蘋果酸完全降解(<0.2 g/L)，表現出良好的降酸能力。與卜瀟等[8]的研究相比，植物乳桿菌經過預適應培養，且在過濾后的葡萄酒中添加了乳酸菌營養劑MALOSTART?之后，相同的菌株能夠完全消耗蘋果酸。BRAVO-FERRADA等[17]將經過MLO培養基預適應的植物乳桿菌在含有4.5 g/L蘋果酸的模擬酒中進行發酵，蘋果酸消耗率顯著提高21%～43%。Fiano葡萄酒中，經過預適應培養的植物乳桿菌M10在未添加營養劑的葡萄酒中幾乎無法代謝蘋果酸[18]。因此，預適應培養與乳酸菌營養劑都是植物乳桿菌是否能夠完全消耗蘋果酸的關鍵因素。

a-赤霞珠葡萄酒中蘋果酸含量；b-赤霞珠葡萄酒中乳酸含量；c-美樂葡萄酒中蘋果酸含量；d-美樂葡萄酒中乳酸含量； e-西拉葡萄酒中蘋果酸含量；f-西拉葡萄酒中乳酸含量；g-蛇龍珠葡萄酒中蘋果酸含量；h-蛇龍珠葡萄酒中乳酸含量圖2 不同品種葡萄酒蘋果酸乳酸發酵過程中蘋果酸和乳酸動態變化Fig.2 Dynamic changes of malic acid and lactic acid concentration in different varieties of wines during malolactic fermentation by L.plantarum

2.3 植物乳桿菌發酵不同品種葡萄酒還原糖與酒精度的變化

由表2可知，蘋果酸乳酸發酵結束后，葡萄糖和果糖被大量利用。在4個不同品種的葡萄酒中，3株菌對葡萄糖的消耗率均達到80%以上，XJ-14在西拉葡萄酒中的葡萄糖消耗率最高，為87.47%。而3株菌對果糖的消耗率為30.77%～74.75%不等，XJ-14在西拉葡萄酒中的果糖消耗率也最高，為74.75%，XJA-2在西拉葡萄酒中果糖消耗率最低，為30.7%。除了美樂葡萄酒，其他品種葡萄酒的乙醇含量均有所上升。在大量蘋果酸被消耗后，葡萄酒的pH值略微上升，此時葡萄酒中剩余還原糖作為碳源仍可以被乳酸菌繼續利用。

表2 植物乳桿菌發酵不同品種葡萄酒還原糖與酒精度的變化Table 2 Reducing sugar and ethanol content in different varieties of wines after malolactic fermentation by L.plantarum

2.4 植物乳桿菌發酵結束后的花色苷含量

通過HPLC共檢出9種單體花色苷，包括5種非酰化的花色苷、1種乙酰化的花色苷和3種香豆酰酰化的花色苷。檢測結果與HE等[19]一致，歐亞種葡萄酒中的花色苷主要是由5種基本花色苷及其乙酰、香豆酰酰化的衍生物構成。

如圖3所示，蘋果酸乳酸發酵結束后，所檢測到的9種花色苷,其含量在4個品種的葡萄酒中各不相同，花色苷總含量最高的為西拉葡萄酒，為27.42 mg/L。赤霞珠葡萄酒中總花色苷含量最低，僅有13.32 mg/L。未接種乳酸菌的葡萄酒，在21 ℃條件下靜置120 h后，單體花色苷總含量均有不同程度的損失，損失率為21.62%(赤霞珠)～67.80%(西拉)。這可能是由于花色苷與乙醛、苯乙烯、丙酮酸進行縮合，形成聚合花色苷[20]。經過植物乳桿菌發酵后，赤霞珠葡萄酒中花色苷總含量均增加了5倍，而蛇龍珠葡萄酒的花色苷總含量損失了44.97%～88.46%。Pn 3-O-Glu為赤霞珠和西拉葡萄酒中的主導單體花色苷，分別占總花色苷的60.44%和60.80%，Pn 3-acetylglc 次之，約占總花色苷的15%。Mv 3-O-Glu和Mv 3-acetylglc是美樂和蛇龍珠葡萄酒中2種主導的單體花色苷，分別占葡萄酒中總花色苷的61.88%和74.13%。經過蘋果酸乳酸發酵，Mv 3-O-Glu成為赤霞珠葡萄酒的主導花色苷，含量上升至51.97～57.63 mg/L，占花色苷總含量的65.14%～65.65%。在西拉葡萄酒中觀察到同樣的現象。梁娜娜等[21]研究發現，葡萄酒釀造過程中各類單體花色苷呈現下降趨勢，較酒精發酵結束后浸漬分汁相比，馬瑟蘭在經過蘋乳發酵后總花色苷含量有所增加，主要為二甲花翠素類花色苷含量增加。這與我們在赤霞珠和西拉葡萄酒中觀察到的一致。

2.5 不同品種葡萄酒的CIELAB參數

a-Dp-3-O-Glu含量；b-Cy-3-O-Glu含量；c-Pt-3-O-Glu含量；d-Pn-3-O-Glu含量； e-Mv-3-O-Glu含量；f-Pn 3-acetylglc含量；g-Mv 3-acetylglc含量；h-Pn 3-p-coumglc trans含量；i-Mv 3-p-coumglc trans含量圖3 發酵結束后不同品種葡萄酒花色苷含量Fig.3 The anthocyanin concentration in different varieties of wines after malolactic fermentation注：Dp 3-O-Glu(花翠素 3-O-葡萄糖苷)，Cy 3-O-Glu(花青素3-O-葡萄糖苷)，Pt 3-O-Glu(3′-甲花翠素 3-O-葡萄糖苷)， Pn 3-O-Glu(甲基花青素 3-O-葡萄糖苷)，Mv 3-O-Glu(二甲花翠素 3-O-葡萄糖苷)，Pn 3-acetylglc[甲基花青素 3-O-(6-O-乙酰基)-葡萄糖苷]， Mv 3-acetylglc[二甲花翠素 3-O-(6-O-乙酰基)-葡萄糖苷]，Pn 3-p-coumglc trans[甲基花青素3-O-(6-O-反式-對香豆酰基]-葡萄糖苷)， Mv 3-p-coumglc trans[二甲花翠素 3-O-(6-O-反式-對香豆酰基)-葡萄糖苷]

以4組酒精發酵剛結束的酒樣處理的CIELAB數據分別作為4組基值，對供試16個酒樣進行色差計算分析，ΔL*、Δa*、Δb*的絕對值大部分>1.5，說明16個處理間色差程度差異明顯。所有處理的ΔL*<0，說明經過蘋果酸乳酸發酵的酒樣的顏色均暗于酒精發酵結束的葡萄酒，其中XJ-25處理酒樣的顏色最暗。這說明經過蘋果酸乳酸發酵后，葡萄酒的顏色會變得老熟，色度會降低，這與之前的研究相一致[23]。16組酒樣的Δa*>0，說明所有處理酒樣顏色中的紅色色調顯著高于對照處理；Δb*值為正數表明偏黃，值為負數表明偏藍。所有處理Δb*<0，說明整體顏色偏藍。在赤霞珠、美樂、蛇龍珠葡萄酒中，XJ-25處理酒樣的顏色都最暗，XJ-14處理酒樣的顏色都最亮。經過蘋果酸乳酸發酵，XJA-2發酵的葡萄酒的色彩飽和程度最好；XJ-14發酵的葡萄酒顏色最亮。

2.6 發酵結束后不同品種葡萄酒中花色苷與CIEAB參數的相關系數

花色苷是葡萄酒主要的呈色物質，其含量和結構穩定性對葡萄酒感官品質具有重要影響[24]。在葡萄酒釀造過程中，花色苷的組成及含量的變化會影響CIELAB顏色參數的變化，二者具有一定的相關性[21]。

將9種單體花色苷與對應的葡萄酒顏色參數進行相關性分析(表4)可知。不同品種的葡萄酒經過植物乳桿菌發酵后，花色苷與葡萄酒的CIELAB參數之間有一定的相關性。Dp 3-O-Glu、Pt 3-O-Glu、Mv 3-O-Glu、Pn-3-acetylglc、Mv-3-acetylglc與Mv-3-p-coumglc trans都呈極顯著正相關。b*與 Cy 3-O-Glu、Pn 3-O-Glu的相關性均<-0.60，呈極顯著負相關，b*值升高(黃色色調增高,紫紅色調降低)，即相關物質含量降低。由表4可知，這2種物質在赤霞珠葡萄酒中顯著降低。L*與a*呈極顯著負相關，b*與a*呈顯著負相關。

表3 發酵結束后不同品種葡萄酒的CIELAB參數Table 3 The CIELAB parameters of different varieties of wines after malolactic fermentation

表4 發酵結束后不同品種葡萄酒中花色苷與CLEAB參數的相關系數 Fig.4 The correlation coefficients of anthocyanins and CIELAB of different varieties of wines after malolactic fermentation

3 結論

在本研究中，分離自新疆赤霞珠葡萄酒的3株植物乳桿菌在4個不同品種的葡萄酒中均表現出較高的菌密度和良好的降酸能力。其中，XJ-25和XJ-14在不同條件的葡萄酒環境中都能夠保持較高的菌密度，有利于進行蘋果酸乳酸發酵。XJ-25在不同葡萄酒中積累的花色苷含量較多，但發酵后的酒樣色度下降明顯，顏色老熟。XJ-14在不同葡萄酒環境中蘋果酸降解能力都最強，且發酵后的酒樣顏色最亮，具有良好的外觀品質。XJA-2發酵后的酒樣色彩飽和度最高，但是在活菌數、糖酸代謝、花色苷積累方面能力都較弱。因此整體來看，XJ-14的蘋果酸乳酸發酵性能更為突出，更具有成為優良發酵劑的商業化潛力。