抑制 TGF-β1/Smads 通路中 Smad7 泛素化降解改善小鼠肺纖維化的作用機制

楊珣 ，邵松軍 ，崔妙雅 ，李霜 ，張湘燕 ，饒珊珊

1 貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科，貴州貴陽 550002；2 貴州航天醫院呼吸與危重癥醫學科；3 國家衛生健康委員會肺臟免疫性疾病診治重點實驗室；4 貴黔國際總醫院呼吸與危重癥醫學科

肺纖維化病因復雜、發病機制不清，主要病理特點為肺泡損傷、大量炎癥細胞浸潤、組織反復修復、細胞外基質過度沉積，致肺功能不可逆性損傷，發病率及病死率較高［1-2］。臨床常用的治療肺纖維化藥物吡非尼酮、尼達尼布均只能延緩肺功能損傷，并不能延長患者生命。目前除肺移植外，仍缺乏對肺纖維化的有效治療手段。TGF-β1/Smads 信號通路與肺纖維化的發生關系密切，Smad7 是該通路的負調控因子，可通過直接或間接作用阻止該通路轉導，抑制肺纖維化進程［3-4］。根據本課題組前期實驗結合文獻報道發現，Smad7 蛋白表達水平在肺纖維化中下降，但基因轉錄水平并未下降，我們推測其機制可能與蛋白降解過多有關。研究顯示，Smad7 蛋白降解主要通過泛素化降解實現［5］。MG132是一種泛素蛋白酶體抑制劑，可有效阻斷靶蛋白泛素化降解［6］。2019年9月—2021年10月，本研究通過博來霉素氣管內一次性給藥建立了小鼠肺纖維化模型，并使用MG132 抑制 TGF-β1/Smads 通路中 Smad7 泛素化降解，觀察其對小鼠肺纖維化的改善作用并分析其機制，以期為肺纖維化的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料 體質量18～20 g 雄性C57BL/6（6周齡）小鼠，由中國第三軍醫大學實驗動物中心提供，動物使用許可號：SCXK（yu）2012-0005。飼養于（22± 2）℃，50% ± 5%濕度，12 h 光照/黑暗循環，自由飲水和食物。10%水合氯醛溶液購自江蘇艾康生物醫藥研發有限公司，10%多聚甲醛購自青島捷世康生物科技有限公司，RIPA 裂解液購自碧云天生物科技公司，博來霉素購自美國Gibco，MG132 購自美國MCE，RNA提取劑TRIzol Reagent購自美國Thermo Fisher Scientific，一抗 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）購自美國CST、Smad7 購自美國SANTA、膠原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）購自英國ABCAM、β-actin 購自武漢Servicebio，泛素抗體anti-Ubiquitin 購自英國ABCAM；羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建成生物有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒購自美國Affinity；反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific。本研究所有動物方案均符合倫理標準。

1.2 動物建模與分組處理 將30 只小鼠試養1 周后按隨機數表法分為對照組、模型組及MG132 干預組，每組10只。模型組及MG132干預組小鼠通過腹腔注射水合氯醛（4%水合氯醛，0.01 mL/g）進行麻醉，5 mg/kg博來霉素一次性氣管內緩慢滴入建立肺纖維化模型，空白組小鼠不做處理。MG132 干預組于造模后第2 天起給予MG132（0.1 mg/kg）腹腔注射，1 次/天，對照組及模型組給予等量生理鹽水腹腔注射。造模28 d后將各組小鼠麻醉處死，采用4%多聚甲醛將小鼠的左肺下葉組織固定，制作石蠟切片。余左肺上葉及右肺組織保存于-80 ℃冰箱用于后續實驗。

1.3 肺纖維化程度觀察方法 ①肺組織形態學觀察：采用HE 染色。將制作好的石蠟切片脫蠟液脫蠟、透明、脫水，去離子水浸洗后，蘇木素染色1 min，1%鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗；1%伊紅染色30 s，脫水、脫蠟液透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。②肺組織膠原含量觀察：采用Masson 染色。將制作好的石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染5～10 min，PBS 漂洗后酸性乙醇分化液分化，Masson 藍化液返藍3 min，流水沖洗后品紅染液染色5～10 min，蒸餾水稍沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理1 min；苯胺藍液或綠液復染2 min，0.2%冰醋酸處理1 min，90%乙醇脫水，無水乙醇脫水，Xylenes 透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。③肺組織中羥脯氨酸含量檢測：采用ELISA 法。使用羥脯氨酸測定試劑盒測定肺組織勻漿中羥脯氨酸含量，每個樣品的吸光度用酶標儀在550 nm 處讀取。使用已知羥脯氨酸含量的樣品生成標準曲線，并根據標準曲線計算肺組織中羥脯氨酸的含量（以肺濕組織質量μg/g 為單位）。每只小鼠用不同的肺組織標本重復實驗3次。肺組織羥脯氨酸含量越高，代表小鼠肺纖維化程度越高。

1.4 肺組織α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取出在-80 ℃冰箱中保存的肺組織，將組織塊用冷PBS 洗滌2～3 次后剪成小塊放入勻漿管中，用細胞裂解液（含PIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物）提取各組肺組織總蛋白，制成蛋白樣品后，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，封閉。分別孵育相應一抗α-SMA（1∶400）、Collagen Ⅰ（1∶400）、Smad7（1∶400）、β-actin（1∶1 000），4 ℃冰箱過夜，次日洗膜，室溫孵育辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶6 000）和羊抗小鼠IgG（1∶6 000），ECL 顯影液曝光。灰度值采用Image Lab掃描并記錄，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ蛋白相對表達量。

1.5 肺組織 α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ、Smad7 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。取各組肺組織約 100 mg 到無 RNA 酶勻漿管中，加入 1 mL 的TRIzol Reagent，根據 TRIzol Reagent 說明書上的步驟提取各組肺組織的總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書步驟將總RNA 反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR 擴增。引物序列：α-SMA 上游引物為5′-CCAGCACCATGAAGATVAAG-3＇，下游引物為 5′-TGGAAGGTAGACAGCGAAGC-3′；TGF-β1上游引物為5′-ACCATGCCAACTTCTGTCTG-3′，下游引物為 5′-CGGGTTGTGTTGGTTGTAGA-3′；Collagen Ⅰ 上 游 引 物 為 5′-AAAGACGGACTCAACGGTCTC-3＇，下游引物為 5′-AAGCTGAAGTCATAACCGCCA-3′；Smad7上游引物為5′-AGCCCTCCCTGGATATCTTCT-3′，下游引物為 5′-CTTGCTCCGCACTTTCTGTAC-3′；GAPDH 上游引物為 5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3＇，下游引物為5′-TGGTCCAGGGTTTATTACTCC-3′。以 GAPDH 為內參，按2－ΔΔCt計算α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ、Smad7 mRNA相對表達量。

1.6 肺組織Smad7 泛素化水平檢測 采用免疫沉淀（IP）將 Smad7 蛋白分離，免疫印跡（IB）觀察Smad7泛素化降解情況。取小鼠肺組織放入勻漿管中，加入 PIPA 裂解液中及 1.0 μg IgG（與 IP 實驗用于沉淀的抗體種屬來源相同的普通IgG）和20 μL A/G 磁珠，將混合液混勻，4 ℃搖轉孵育1 h 后離心5 min（4 ℃，2 000 r/min）；取上清液加入Smad7 一抗（1∶1000），使相互作用的兩種蛋白質其中一種沉淀，4 ℃孵育過夜；加入 80 μL A/G 磁珠，混勻后 4 ℃搖轉孵育2 h，離心5 min（4 ℃，1 000 r/min）；取上清液收集免疫復合物，用1 mL IP 裂解液洗滌4 次，每次均離心5 min（4 ℃，1 000 r/min），洗滌后去除上清；加入80 μL 上樣緩沖液沸水煮10 min，沸水浴后離心5 min（4 ℃，1 000 r/min）取上清液，用免疫沉淀得到的Smad7 蛋白上清液樣品，孵育一抗為泛素抗體（1∶1 000），上樣做Western blotting 檢測。Input 道上樣為未做IP 前的對照組蛋白樣品，余電泳步驟同“1.4”。

1.7 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件。計量資料通過Sample K-S 進行正態檢驗，符合正態分布的以表示，組間比較行t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺纖維化程度比較 HE染色結果顯示，對照組小鼠肺組織肺泡間隔、肺泡腔無明顯異常，結構完整；模型組小鼠肺泡腔狹窄、塌陷，肺泡間隔增厚，肺泡、氣管周圍血管見較多中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，肺組織正常結構遭到破壞；MG132 干預組小鼠肺泡腔破壞、肺泡間隔增厚等改變減輕，炎癥細胞浸潤減少，肺組織結構破壞程度減輕。見OSID碼圖1a。Masson染色結果顯示：對照組鏡下藍紫色面積最小，肺泡間隔、肺泡間質、肺泡壁結構基本完整，無明顯膠原纖維沉積；模型組鏡下見大片藍紫色視野分布在肺間質、肺泡間隔，顯示膠原纖維大量沉積。MG132 干預組藍紫色視野面積較模型組縮小，肺組織纖維化病變程度較模型組輕。見OSID碼圖1b。羥脯氨酸含量檢測結果顯示，對照組、模型組及MG132 干預組小鼠肺組織羥脯氨酸含量分別為（1.23 ± 0.61）、（2.25 ± 0.82）、（1.79 ± 0.52）μg/mg，肺組織羥脯氨酸含量模型組＞MG132 干預組＞對照組（P均＜0.05）。

2.2 各組小鼠肺組織α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ蛋白表達比較 各組小鼠肺組織α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白表達比較，模型組＞MG132 干預組＞對照組；Smad7 蛋白表達比較，對照組＞MG132 干預組＞模型組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺組織α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ蛋白表達比較（）

表1 各組小鼠肺組織α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組MG132干預組Collagen Ⅰ0.17±0.06 0.55±0.09*0.37±0.08#n 10 10 10 α-SMA 0.68±0.14 2.09±0.98*1.25±0.32#Smad7 1.78±1.02 1.19±0.18*1.44±0.32#

2.3 各組小鼠肺組織α-SMA、Smad7、CollagenⅠ、TGF-β1mRNA 表達比較 各組小鼠肺組織α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ、TGF-β1mRNA 表達比較，模型組＞MG132 干預組＞對照組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肺組織α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA表達比較（）

表2 各組小鼠肺組織α-SMA、Smad7、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組MG132干預組TGF-β1 0.0027±0.0005 0.0069±0.0012*0.0042±0.0004#n 10 10 10 α-SMA 0.0018±0.0003 0.0046±0.0009*0.0037±0.0007#Smad7 0.0023±0.0008 0.0055±0.0007*0.0039±0.0005#Collagen Ⅰ0.0022±0.0005 0.0044±0.0009*0.0037±0.0008#

2.4 各組小鼠肺組織Smad7 泛素化水平比較 各組小鼠肺組織Smad7 泛素化水平比較，模型組＞MG132干預組＞對照組。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織Smad7泛素化水平比較

3 討論

博來霉素氣管內一次性給藥是目前常用的構建肺纖維化模型的方法，肺纖維化的病理生理特征包括肺泡炎癥損傷后異常纖維化性修復［7-8］。肺泡損傷后，TGF-β/Smads通路激活，肺泡上皮細胞向間充質細胞轉化，α-SMA 表達減少，誘導成纖維細胞活化增殖、轉化，產生大量膠原，異常沉積在細胞外基質引起肺纖維化。Collagen Ⅰ是肺纖維化組織中主要成分之一，而羥脯氨酸是Collagen Ⅰ的重要組成成分，僅在彈性蛋白和膠原蛋白中表達，但在動物組織膠原中幾乎均存在，因此膠原含量的多少可以判斷肺組織肺纖維化的程度。本實驗結果顯示，建模28 d后，模型組肺組織HE染色可見肺組織結構遭到破壞，肺泡腔出現塌陷狹窄，肺泡間隔異常增厚，肺間質中較多炎性細胞浸潤；Masson 染色鏡下顯示膠原蛋白呈現為藍紫色，模型組藍紫色面積明顯擴大，提示膠原蛋白含量增多；同時，模型組肺組織羥脯氨酸含量增多也表示模型組肺組織膠原蛋白含量增多。而根據我們的觀察，MG132 干預組肺纖維化程度較模型組有一定的改善，提示抑制Smad7 泛素化降解對改善小鼠肺纖維化有積極的作用。

肺纖維化的發病機制尚不清楚，大多數學者認為主要與TGF-β1/Smads 信號通路激活、自噬不足、氧化損傷、端粒縮短及表觀遺傳學改變（DNA 甲基化、組蛋白去乙酰化）等有關［9-10］。TGF-β1mRNA 和蛋白表達在肺纖維化中均升高，其與上皮間充質轉化過程關系密切，在肺纖維化中發揮關鍵作用。本實驗結果也顯示，模型組肺組織中TGF-β、α-SMA Collagen ⅠmRNA 及蛋白表達水平均有升高，提示給予小鼠博來霉素氣管滴注后，TGF-β1/Smads 信號通路激活并發揮了致纖維化效應，與本課題組前期研究及文獻報道一致［6］。

有研究顯示，在肺纖維化中，Smad7蛋白表達下降，上調Smad7 表達水平能減輕肺纖維化［11］。本研究發現，模型組肺組織中Smad7 蛋白表達水平較對照組明顯降低，但是其基因轉錄水平并未下降。與對照組比較，模型組Smad7 mRNA 表達上調，與其蛋白表達水平相反。這與本課題組前期肺纖維化模型實驗結果一致，也與其他學者實驗結論相符合［6］。Smad7 的mRNA 表達增多，說明基因轉錄并未受到抑制，而Smad7 的蛋白水平下降可能與其降解增多有關。有研究發現，泛素化是Smad7 蛋白的主要降解方式［12］。泛素蛋白酶體抑制劑MG132 可阻斷靶蛋白泛素化降解，有研究顯示MG132 具有抗纖維化作用，但其抗纖維化機制至今尚不明確［13-14］。泛素蛋白酶體途徑蛋白降解的重要途徑之一，真核細胞內蛋白質可被該途徑特異性降解。泛素連接酶中的Smad 泛素化調節因子2（Smurf2），在TGF-β1/Smads信號通路中能夠選擇性泛素化降解Smad7，從而調節TGF-β1/Smads 信號通路的轉導，影響臟器纖維化的發生發展［15］。我們的研究結果顯示，在模型組肺組織中，Smad7 蛋白泛素化水平明顯增高。這提示Smad7基因轉錄和蛋白表達水平不一致的現象可能與Smad7蛋白泛素化水平增高導致Smad7蛋白降解增多有關，在一定程度上解釋了為什么Smad7 在肺纖維化中基因轉錄活化增強但是其蛋白水平降低的原因。Smad7蛋白水平下降導致其對TGF-β1/Smads的負性調節作用減弱，從而與本實驗結果中纖維化基因α-SMA、Collagen Ⅰ表達增多，羥脯氨酸含量增加相符合。

本研究使用MG132 干預小鼠肺纖維化模型，發現Smad7 泛素化水平下降，Smad7 蛋白表達增高，小鼠肺纖維化病理改變減輕，α-SMA、Collagen Ⅰ基因表達下調、蛋白表達減少，羥脯氨酸含量減少，這可能是MG132 抑制了Smad7 蛋白泛素化降解，從而提高了Smad7 對TGF-β1/Smad 信號通路的負向調控作用。研究顯示，Smad7 可以在細胞核內與Smurf2 形成復合物，該復合物與TGF-β1受體TβRⅠ在細胞質內脂質小囊結合，在Smurf2的作用下，TβRⅠ泛素化降解。且有研究發現，MG132 可通過調節Smurf2/Smad7信號傳導調控小鼠肺血管內皮細胞向間充質細胞轉化，從而抑制肺纖維化的發生發展［14］。因此，MG132 可能作用于Smurf2-Smad7 復合物，通過抑制Smurf2 從而抑制Smad7 泛素化降解，但其具體機制需要結合體外實驗進一步研究。

綜上所述，本研究通過博來霉素氣管內一次性給藥建立了小鼠肺纖維化模型，并給予泛素蛋白酶體抑制劑MG132 進行干預。研究結果顯示，MG132可改善博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，下調纖維化基因α-SMA、Collagen Ⅰ等的表達，該機制可能與MG132 抑制 Smad7 泛素化降解，從而上調 Smad7 蛋白表達，增強 Smad7 對 TGF-β1/Smads 信號通路的負性調節作用有關。