LncRNA KCNQ1OT1 降表達對順鉑耐藥卵巢癌細胞耐藥性的影響及其作用機制

沈艷麗，馮文廣，楊靜，伊婷，易金玲

新疆醫科大學第五附屬醫院婦科，烏魯木齊 830011

目前，卵巢癌是病死率位居前列的婦科惡性腫瘤，其治療方案以手術、化療、放療等綜合治療為主［1］。但在化療過程中相當多的患者由于卵巢癌細胞耐藥而導致化療失敗，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性是提高卵巢癌治療效果的有效途徑［2］。腫瘤耐藥為多因素參與的對腫瘤藥物的抵抗，包括減少凋亡、增加修復DNA 損傷、減少攝取水溶性藥物、改變藥物的代謝等［3］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度大于200 nt 的非編碼RNA，越來越多的研究發現其在機體正常的生長發育以及疾病發展等多種生物學過程中發揮重要調控作用。LncRNA KCNQ1OT1 位于人類染色體11p15.5，研究顯示其與肺癌的增殖和耐藥有關［4-5］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可介導多種蛋白如缺氧誘導因子（HIF-1α）等的產生［6］，而蛋白激酶B（AKT）是其上游調控關鍵蛋白。AKT/mTOR 信號通路與人類多種腫瘤密切相關，在腫瘤細胞增殖、凋亡、血管發生、轉移及放化療抵抗中均發揮重要作用［7］。2020年3月—2021年3月，為了進一步了解卵巢癌細胞順鉑（DDP）耐藥的相關機制，本研究觀察分析KCNQ1OT1 調控AKT/mTOR 信號通路對卵巢癌細胞順鉑耐藥的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 實驗細胞：SKOV-3 人卵巢癌細胞來源于普諾賽生物，細胞培養條件為McCoy′s 5A+10%胎牛血清（FBS）+1%PS，37 ℃，5% CO2，飽和濕度。主要試劑與耗材：FBS（Excell Bio，FND500）；McCoy′s 5A 培養基（GIBCO，16600-082）；0.25%胰酶（GIBCO，25200-056）；PBS 粉劑（北京中杉金橋生物，ZLI-9062）；10 000 U 青霉素—鏈霉素雙抗（GIBCO，15070-063）；DMSO（Sigma，D2650）；CCK-8 細胞增殖/毒性檢測試劑盒（全式金生物，FC101-04）；DDP（Sigma，P4394）；25 cm2培 養 瓶（Corning，430639）；96 孔板（Corning，3599）；KCNQ1OT1-si RNA 及NC-siRNA（蘇州吉瑪基因）；p-AKT（兔多克隆抗體，abcam，ab8805）；p-mTOR（兔單克隆抗體，abcam，ab109268）。主要儀器：CO2細胞培養箱（上海力康儀器，Smart Cell HF-90）；生物安全柜（上海力康儀器，HF1200LC）；臺式低速離心機（上海飛鴿儀器，DK-80）；恒溫水浴鍋（上海精宏儀器；TGL-16GB）；熒光倒置顯微鏡（日本尼康，Eclipse TS100-F）；-20 ℃低溫冰箱（合肥美菱，BCD-249LCK）；-80 ℃低溫冰箱（合肥美菱，DW-HL388）；手動單道移液器（Eppendorf，Research plus）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的復蘇與傳代 細胞復蘇：從液氮罐中取出凍存的細胞，將其立即置于37 ℃水浴中快速搖晃的凍存管，使細胞在2 min 內快速解凍；將解凍后的細胞快速加入放有完全培養基的離心管內，離心后棄去上清；將細胞接種于培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱內培養。細胞傳代：當細胞融合至80%左右時，棄去瓶中的培養基，加入3 mL 無菌PBS 緩沖液沖洗2 遍；棄去PBS 后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，輕搖培養瓶，消化1 min 后加入1 mL 完全培養基終止消化；用吸頭反復沖洗培養瓶，將脫落的細胞轉移至15 mL 離心管中，離心5 min 后棄去液體；用2 mL完全培養基重懸沉淀細胞，計數細胞并調整細胞密度1×105/mL；將其接種于培養瓶中培養，37 ℃、5%CO2培養箱內培養。

1.2.2 卵巢癌DDP 耐藥細胞株構建 取對數生長期的SKOV-3 細胞，當細胞融合達70%左右時，在培養基中加入0.1 μg/mL DDP 培養48 h；棄去含藥培養基，用不含藥培養基繼續培養；待細胞生長融合至90%，使用上述步驟重復誘導2 次。待細胞長滿傳代后，使用小劑量（0.1 μg/mL）到高劑量（0.5 μg/mL）濃度遞增干預。其間使用不同濃度DDP誘導階段計算耐藥指數（RI），當RI≥4 時，則認為耐藥細胞株建立成功。CCK-8 檢測 SKOV-3、SKOV-3/DDP 耐藥株50%細胞生長的藥物濃度（IC50）并計算RI：取對數生長期的SKOV3、SKOV3/DDP 細胞，用完全培養基將其制備成5×104/mL 單細胞懸液；將其接種至96 孔板中，每孔 100 μL。培養 24 h 待細胞貼壁后棄去培養基，并加入不同濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL）DDP溶液，每個濃度設5個復孔，同時設空白孔；繼續培養72 h后棄去培養基，每孔加入CCK-8 溶液100 μL，置于37 ℃孵箱內1 h；用酶標儀檢測各孔在450 nm 波長處的OD 值，計算IC50及RI。細胞增殖抑制率（%）=［（OD對照孔-OD實驗孔）/OD對照孔］×100%。RI=耐藥細胞系的IC50/敏感細胞系的IC50。

1.2.3 SKOV3、SKOV3/DDP 細胞 KCNQ1OT1 表達檢測 采用qRT-PCR 法。用TRIzol 法提取SKOV-3、SKOV-3/DDP細胞總RNA，檢測其濃度和純度后，應用MMLV 反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，應用qRT-PCR 法檢測SKOV-3、SKOV-3/DDP 細胞KCNQ1OT1 表達，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：KCNQ1OT1上游為 5′-CTTTGCAGCAACCTCCTGT-3′，下游為5′-TGGGGTGAGGGATCTGAA-3′；GAPDH 上游為5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下 游 為 5′-TTGATTTTGGAGGATCTCG-3′。 PCR 反 應 條 件 ：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共完成 45 個循環 。 以 GAPDH 作 為 內 參 ，使 用 2－△△Ct法 計 算KCNQ1OT1相對表達量。

1.2.4 SKOV3/DDP 細胞分組與 KCNQ1OT1 降表達轉染 取對數生長期的SKOV-3/DDP 細胞，常規培養后接種于6孔板；待細胞融合至約70%時，將細胞分為KCNQ1OT1 降表達組、轉染對照組和對照組，KCNQ1OT1 降表達組、轉染對照組參照Lipofectamine 2000 說明書進行轉染。KCNQ1OT1 降表達組細胞轉染KCNQ1OT1-siRNA，轉染對照組細胞轉染NC-siRNA，對照組正常培養不轉染。轉染5 h后更換為新鮮培養基，繼續培養48 h 后收集各組細胞。采用qRT-PCR 法檢測KCNQ1OT1，方法同“1.2.3”，觀察降表達效果。

1.2.5 KCNQ1OT1 降表達的 SKOV3/DDP 細胞耐藥性觀察 收集轉染48 h 后的各組細胞，并加入不同濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL）DDP 溶液，每個濃度設5 個復孔，同時設空白孔；繼續培養72 h 后棄去培養基，采用CCK-8 法檢測DDP對各組細胞增殖情況，并計算增殖抑制率、IC50及RI，方法同“1.2.2”。

1.2.6 KCNQ1OT1降表達的SKOV3/DDP細胞周期檢測 收集“1.2.4”轉染48 h后的各組細胞，加入預冷的70%乙醇溶液，在-20 ℃下孵育2 h。棄去上清后，分別加入5 μg/mL的RNase 0.1 mL、50 μg/mL 的碘化丙啶（PI）0.5 mL，放置于37 ℃環境下避光反應30 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期。

1.2.7 KCNQ1OT1 降 表 達 的 SKOV3/DDP 細 胞AKT/mTOR 信號通路活性檢測 采用Western blotting 法。收集“1.2.4”轉染 48 h 后的各組細胞，加入100 μL RIPA 及 1 μL PMSF 裂解細胞并提取細胞總蛋白；采用BCA 法檢測蛋白濃度，并根據蛋白濃度取樣、加熱變性后進行SDS-PAGE 電泳；電泳后轉移至PVDF 膜，使用5% 脫脂奶粉封閉2 h；加入p-AKT、p-mTOR 抗體 4 ℃孵育過夜，使用 TBST 洗滌3 次；加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育1 h，TBST 洗滌3 次后加入發光液；使用凝膠成像儀拍照并進行灰度分析，以目的蛋白與β-actin灰度比值表示p-AKT、p-mTOR相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗法進行正態分布檢驗，正態分布以表示，多組比較行單因素方差分析，重復測量數據行重復測量的方差分析；非正態分布以中位數（四分位數間距）表示，采用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌DDP 耐藥細胞株構建結果 由表1 可見，隨著 DDP 濃度增加，SKOV-3 及 SKOV-3/DDP 細胞增殖抑制率均升高（P均＜0.05）；在相同DDP濃度下，SKOV-3/DDP細胞增殖抑制率低于SKOV-3細胞增殖抑制率（P均＜0.05）；DDP 對 SKOV-3 細胞 IC50為 1.224 μg/mL，DDP 對 SKOV-3/DDP 細胞 IC50為4.920 μg/mL，RI 為 4.020，成功構建卵巢癌 DDP 耐藥細胞株。

表1 不同濃度DDP作用下SKOV3、SKOV3/DDP細胞增殖情況比較（，n=6）

表1 不同濃度DDP作用下SKOV3、SKOV3/DDP細胞增殖情況比較（，n=6）

注：與 0.25 μg/mL DDP 比較，aP＜0.05；與 0.50 μg/mL DDP 比較，bP＜0.05；與1.00 μg/mL DDP比較，cP＜0.05；與2.00 μg/mL DDP比較，dP＜0.05；與4.00 μg/mL DDP 比較，eP＜0.05；與DDP 同濃度作用的SKOV-3細胞比較，fP＜0.05。

SKOV-3/DDP 2.982±2.820f 8.042±5.304f 15.782±4.230abf 28.276±4.111abcf 40.319±4.696abcdf 65.068±5.201abcdef DDP（μg/mL）0.25 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00細胞增殖抑制率（%）SKOV-3 5.991±3.796 20.812±3.807a 48.027±4.210ab 69.957±3.559abc 82.198±4.745abcd 91.922±4.008abcde

2.2 SKOV-3、SKOV-3/DDP 細胞 KCNQ1OT1 表達比較 SKOV-3/DDP細胞KCNQ1OT1相對表達量為2.482 ± 0.405，高于 SKOV-3 細胞的 1.088 ± 0.241（P＜0.05）。

2.3 各組SKOV-3/DDP 細胞KCNQ1OT1 表達比較 KCNQ1OT1 降表達組細胞中KCNQ1OT1 相對表達量為0.428 ± 0.157，低于轉染對照組的1.024± 0.305 及對照組的 0.978 ± 0.215（P均＜0.05），轉染對照組與對照組間差異無統計學意義。

2.4 各組SKOV-3/DDP 細胞耐藥性比較 由表2可見，隨DDP 濃度增加，各組細胞增殖抑制率均升高（P均＜0.05）；在相同DDP 濃度下，KCNQ1OT1 降表達組細胞增殖抑制率均高于轉染對照組和對照組（P均＜0.05）。DDP對KCNQ1OT1降表達組細胞IC50為 3.613 μg/mL，RI 為 0.734；DDP 對轉染對照組、對照組細胞 IC50分別為 9.737、8.461 μg/mL，RI 分別為1.979、1.720。

表2 不同濃度DDP作用下各組SKOV-3/DDP細胞細胞增殖情況比較（，n=6）

表2 不同濃度DDP作用下各組SKOV-3/DDP細胞細胞增殖情況比較（，n=6）

注：與0.25 μg/ML DDP 比較，aP＜0.05；與0.50 μg/mL DDP 比較，bP＜0.05；與1.00 μg/mL DDP 比較，cP＜0.05；與2.00 μg/mL DDP 比較，dP＜0.05；與4.00 μg/mL DDP比較，eP＜0.05；與同濃度轉染對照組比較，fP＜0.05；與同濃度對照組比較，gP＜0.05。

細胞增殖抑制率）（%）8.00 μg/mL DDP 75.684±5.849abcdefg 63.046±5.674abcde 64.382±6.082abcde組別2.00 μg/mL DDP 41.204±5.674abcfg 30.493±5.217abc 32.363±4.901a 0.25 μg/mL DDP 5.986±1.093fg 3.184±1.283 2.908±2.165 0.50 μg/mL DDP 11.398±3.483afg 7.894±3.023a 8.336±2.018a 1.00 μg/mL DDP 26.583±4.005agfg 16.220±4.282ab 18.943±3.099ab 4.00 μg/mL DDP 57.384±6.038abcdfg 43.220±4.975abcd 45.642±5.229abcd KCNQ1OT1降表達組轉染對照組對照組

2.5 各組SKOV-3/DDP細胞周期分布比較 見表3。

表3 各組SKOV-3/DDP細胞周期分布比較（，n=6）

表3 各組SKOV-3/DDP細胞周期分布比較（，n=6）

注：與同濃度轉染對照組比較，fP＜0.05；與同濃度對照組比較，gP＜0.05。

G2/M期18.27±2.95fg 31.95±3.44 33.47±4.21組別KCNQ1OT1降表達組轉染對照組對照組細胞周期（%）G0/G1期62.18±4.39fg 43.47±6.50 42.39±5.49 S期20.34±2.35fg 25.63±3.20 24.03±2.85

2.6 各組 SKOV-3/DDP 細胞 p-AKT、p-mTOR 蛋白表達比較 見表4。

表4 各組SKOV-3/DDP細胞p-AKT、p-mTOR蛋白表達比較（，n=6）

表4 各組SKOV-3/DDP細胞p-AKT、p-mTOR蛋白表達比較（，n=6）

注：與同濃度轉染對照組比較，fP＜0.05；與同濃度對照組比較，gP＜0.05。

組別KCNQ1OT1降表達組轉染對照組對照組p-AKT 0.485±0.120fg 0.892±0.214 0.902±0.116 p-mTOR 0.849±0.152fg 0.682±0.123 0.674±0.142

3 討論

由于卵巢癌在化療過程中極易出現耐藥，常導致治療進入瓶頸。因此，研究卵巢癌耐藥的分子機制及其逆轉耐藥的方式，已成為當前婦產科領域亟需攻克的難題之一。

目前，在人類基因中包含的具有編碼蛋白質功能的基因約為20 000 個，僅占人類整個基因組的1.5%左右［8］，而其余的基因被稱為非編碼RNA。隨著研究的不斷深入，發現無論LncRNA 還是短鏈非編碼RNA，均對人類的多種疾病具有調控作用［9］。近年來越多越多的研究顯示，在卵巢癌中存在某些異常表達的LncRNA，且某些LncRNA 已被證實具有調控腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡及腫瘤細胞耐藥等過程，從而發揮相應的抗癌、抑癌基因作用［10-12］。

LncRNA KCNQ1OT1 是 KCNQ1 的反義鏈轉錄物，其在多種惡性腫瘤組織中表達量升高，故推測KCNQ1OT1 可作為腫瘤診斷、治療預后的重要標志物，并具有促癌作用［13］。然而，KCNQ1OT1是否參與卵巢癌的DDP 耐藥過程，目前尚無相關研究報道。AKT 是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K 下游的一個作用靶點；mTOR則是一種與PI3K/AKT通路密切相關的蛋白激酶，mTOR 作為AKT的底物可被激活。研究認為［14］，AKT/mTOR 信號通路在惡性腫瘤發生、發展、侵襲、轉移以及化療耐藥等多種過程中均具有顯著的影響作用，其作用主要表現在促進腫瘤細胞增殖而抑制腫瘤細胞凋亡，同時促進腫瘤血管生成等。為進一步了解卵巢癌DDP 耐藥機制，并從基因層面尋求逆轉卵巢癌耐藥的途經，本研究分析了KCNQ1OT1 是否通過調控AKT/mTOR信號通路對卵巢癌細胞DDP耐藥產生影響。

本研究經DDP 反復間歇沖擊誘導法構建卵巢癌細胞DDP 耐藥細胞株SKOV3/DDP，構建后顯示對 SKOV-3/DDP 細胞 DDP 的 RI 為 4.020。這提示SKOV3/DDP 細胞株構建成功，與相關報道結果相似［15-16］。關于卵巢癌細胞DDP 耐藥的機制，目前主要認為與以下幾條途徑有關［17］：①細胞解毒系統增強，導致藥物迅速滅活；②改變藥物靶點，從而降低藥物的作用效力；③減少化療藥物的攝入，同時增加化療藥物外排；④增強細胞DNA 修復能力，同時提高抗凋亡基因的表達能力。

本研究結果顯示，SKOV-3/DDP 細胞中KCNQ1OT1 表達量高于SKOV-3 細胞；與轉染對照組和對照組比較，KCNQ1OT1降表達組細胞G0/G1期細胞比例升高，p-AKT 蛋白表達量降低而p-mTOR 蛋白表達量升高。這提示KCNQ1OT1 參與了卵巢癌細胞DDP 耐藥過程，且干擾KCNQ1OT1 表達可有效抑制SKOV3/DDP 細胞增殖活性，即干擾KCNQ1OT1表達可有效逆轉卵巢癌細胞耐藥。其逆轉耐藥的機制可能與阻滯細胞周期于G0/G1期，以及調控AKT/mTOR通路有關。而AKT/mTOR通路在前期本實驗室研究中已證實參與卵巢癌細胞耐藥過程，是細胞耐藥的重要機制之一。因此，干擾KCNQ1OT1 表達可有效逆轉卵巢癌細胞DDP 耐藥，其機制與阻滯耐藥細胞于G0/G1期及調控AKT/mTOR 信號通路有關，這可能成為卵巢癌耐藥逆轉的潛在途徑。