銀杏類黃酮合成關鍵基因的鑒定和GbANR2的基因的克隆

季雅菲

（中國農業大學，北京 100089）

1 引言

1.1 背景介紹

銀杏（Ginkgo bilobaL.）俗稱“白果”，為我國特有珍貴樹種，在植物界享有“活化石”之稱，集生態防護、觀賞、經濟等價值為一體，具有良好開發前景和研究價值[1]。

類黃酮是大多數植物中含量較多的一類次生代謝物，原花青素是類黃酮中的主要成分之一，主要由花青素還原酶（ANR）調控合成[2]。由于原花青素等黃酮類化合物能為農作物提供良好性狀，提高食品的保健作用，還可以為轉基因材料著色[3]，故而該類化合物的合成途徑的相關研究逐漸受到人們的關注。

1.2 研究目的及意義

近年來，研究者已經相繼從一些植物中，如杉木、擬南芥中克隆了ANR 基因，并進行了相關的遺傳和生化研究，但是銀杏GbANR2基因的克隆與表達分析的分子機制鮮有報道[4-5]。本研究以類黃酮合成途徑為切入點，通過基因共表達分析鑒定出合成途徑中的關鍵結構基因，對關鍵基因GbANR2進行了基因克隆，并對其進行生物學分析。本研究將為明確GbANR2對銀杏類黃酮的合成的作用提供理論基礎，為定向培育高類黃酮含量的優質銀杏植株提供理論基礎。

2 材料方法

2.1 銀杏黃酮類化合物合成相關結構基因的共表達分析

從NCBI Sequence Read Archive（SRA）數據庫（https://github.com/ncbi/sra-tools）中下載126 個銀杏樣本的高質量轉錄組（RNA-seq）數據，對其進行數據處理獲得126 個樣品中所有基因的表達數據[7-8]。將通過KEGG 鑒定出的銀杏類黃酮合成途徑中的48個結構基因進行基因共表達分析，計算所有基因之間的皮爾森相關系數（PCC），篩選PCC＞0.75 的基因，并利用Cytoscape軟件實現基因的共表達網絡的可視化。

2.2 GbANR2基因克隆

2.2.1 試驗試劑

本試驗所用的主要試劑有：RNA 試劑盒（Omega，R6827-01，廣州）、反轉錄MonScript?RTIII All-in-One Mix with dsDNase 試劑盒、Phanta?Max Super-Fidelity DNA 高保真酶試劑盒、大腸桿菌感受態細胞（Tsingke，TSC01，北京）、DL5000DNA Marker（Tsingke，TSJ012-500，北京）、pClone007 Blunt Simple Vector Kit載體試劑盒、TAE溶液、ddH2O無菌水。

2.2.2 基因克隆

（1）RNA 提取及純度測定。試驗過程中的RNA 提取步驟按照試劑盒（Omega，R6827-01，廣州）說明進行。摘取銀杏幼葉，磨樣、渦旋、孵育、離心、渦旋，直至所有樣品轉移到色譜柱中。加入RWF洗滌緩沖液，丟棄濾液和收集管。

（2）引物設計。提取DNA 甲基化相關基因CDS 序列，使用Primer Primier 程序設計引物，采用直接擴增的方式進行克隆。正向引物（5’-3’）為ATGGCACCGCAGGCTTATCC，反向引物（5’-3’）為TTAGCAGGTAAGCAAGCCCTTGG。

（3）目的片段凝膠回收。切下含目的DNA 片段凝膠，加入等倍體積的Buffer GDP，水浴，短暫離心，將FastPure DNA Mini Columns-G 吸附柱置于Colletion Tubes 2 mL 收集管中，將≤700 μL的溶膠液轉移至吸附柱中，將濾液棄除，吸附柱置于收集管中。靜置，濾液棄除，重復前一步驟，將吸附柱置于在離心管中，加入Elution Buffer 至吸附柱中央，靜置，棄去吸附柱，離心管存于-20°C。

（4）目的片段連接與轉化。取100 μL大腸桿菌感受態細胞，加入連接產物，靜置。將其放入水浴中激活45 s，靜置。加入無抗性SOC/LB 培養液，搖1 h。將復蘇液涂抹至含氨芐青霉素（Amp）的培養基上，倒置過夜12～16 h。

2.3 GbANR2生物信息學分析

2.3.1GbANR2基因結構分析及染色體定位

基于銀杏基因組數據庫中基因的位置信息，運用TBtools軟件實現目的基因的基因結構的可視化。

2.3.2GbANR2蛋白結構預測

利用SWISS-MODEL 在線軟件分析銀杏ANR 蛋白三維結構模型，并與蛋白質二級結構預測結果進行比較。

2.4 GbANR2在銀杏不同組織中的表達

選取銀杏成年根（R）、成年莖（S）、未成熟葉片（IL）、成熟葉片（ML）、雌球果（OS）、大孢子葉球（M）、未成熟果實（IF）與成熟果實（MF），利用GraphPad 進行作圖，分析GbANR2 在銀杏不同組織中的表達量。

3 結果分析

3.1 基因共表達分析鑒定銀杏類黃酮合成途徑的核心結構基因

利用處理后的126 個銀杏公共轉錄組數據[6]，對48 個類黃酮合成結構基因進行共表達分析（PCC＞0.75），篩選出12個高度相關的核心基因[7]，這些基因在類黃酮合成中發揮重要作用，現將其定義為參與類黃酮合成的核心基因。分別為CHS5、4CL2、DFR2、F3’H1、ANR3、PAL4、CHS1、ANS1、ANR2、CHI、CHS4、F3H1。

3.2 GbANR2基因克隆

3.2.1 目的基因的擴增與純化

以cDNA 為模板，利用Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase 進行GbANR2（Gb_10028）基因克隆，如圖1，將所有的PCR 產物進行電泳檢測并且進行切膠回收、轉化和陽性克隆鑒定。

圖1 類黃酮通路相關核心結構基因的共表達分析Fig.1 The analysis on coexpression of core structure genes relatedto flavonoid pathway

3.2.2 克隆序列比對

將擎科公司測序結果使用NCBI 網站進行分析，將測序結果與原DNA 序列輸入進行比對，根據多序列比對結果可知，克隆序列與目的基因的序列完全相同，大小為1029bp，編碼341個氨基酸。

3.3 GbANR2的生物信息學分析

3.3.1GbANR2的基因結構和染色體定位

運用TBtools 進行基因結構可視化分析，得出GbANR2基因分布在3號染色體上，具有4個內含子、5個外顯子，長度為1029bp。通過DANMAN 軟件對GbANR2堿基序列進行翻譯，得到由341個氨基酸組成的蛋白質。

3.3.2GbANR2同源性分析

使用Blast 將GbANR 序列與其它植物的ANR 基因序列進行比對，結果顯示GbANR 基因的核苷酸序列與其它植物的ANR基因的核苷酸序列同源性非常高，尤其是裸子植物的白云杉和北美云杉，相似性分別為74.44%和74.24%，說明GbANR 與來自裸子植物的ANR 具有較近的親緣性。此外，GbANR 與日本柳杉、野茶樹、蘋果的相似性依次為72.59%，65.32% 和64.99%。因此，從蛋白質序列比較結果推測GbANR正是銀杏ANR基因家族成員之一。

3.3.3GbANR2蛋白結構預測

通過SOPMA 預測蛋白質的二級結構，結果顯示，GbANR2蛋白結構中α 螺旋有141 個氨基酸，所占比例為41.23%；β 轉角有27 個氨基酸，所占比例為7.89%，延伸鏈（Extended strand）有50 個氨基酸，所占比例為14.62%，無規則卷曲（Random coil）有124 個氨基酸，所占比例為36.26%。使用Swiss-model 對GbANR2蛋白的三級結構進行預測，結果顯示，GbANR2以花青素還原酶為模板構建，兩者蛋白的三級結構相似性為59.16%，模型主要包括12 個α 螺旋與10個β 轉角。

3.4 GbANR2在銀杏不同組織中的表達

銀杏發育過程中，GbANR2基因在根、莖中表達量較低，而生長初期相反，表達量較高，而后又迅速下調，使花青素得以積累。在不同的銀杏組織中，ANR 基因的表達量均有所不同，依次是IF＞OS＞IL＞MF＞R＞S＞ML＞M ,表達量結果差異顯著。

4 結語

本研究從銀杏公共數據庫中下載了銀杏轉錄組數據126個，對原始數據進行處理和均一化，以皮爾森相關系數PCC＞0.75 為標準，鑒定出12 個關鍵核心基因。其中GbANR2基因與其它基因的相互調控關系較為緊密，對該基因進行了克隆，并對其在染色上位置、基因結構、蛋白結構，以及在不同組織中的表達量進行了分析。研究表明ANR基因在在根、莖中的表達量較低，在葉、果實中的表達量較高，ANR基因在植物特定器官表達中起重要作用。

類黃酮在銀杏葉中具有重要作用，因此研究銀杏類黃酮代謝途徑，并利用相關基因進行有效的調控是獲得高產類黃酮的基礎。本研究鑒定了銀杏類黃酮合成關鍵基因，克隆了銀杏GbANR2基因。為了更好得進行后續研究，可以從銀杏幼葉中選取表達量較高的其它核心基因進行克隆，為研究銀杏類黃酮合成途徑提供豐富的理論依據。