蠟梅花配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

張 強(qiáng)，曾令連，李 磊

（1.仲景宛西制藥股份有限公司，河南 南陽 474550； 2.河南省中藥固體制劑技術(shù)創(chuàng)新中心，河南 南陽 474550）

蠟梅花為蠟梅科植物蠟梅Chimonanthuspraecox（L.）Link 的花蕾，有解暑清熱、理氣開郁功效［1］，常用于治療暑熱煩渴、頭暈、胸悶脘痞、梅核氣［2］、咽喉腫痛、百日咳、小兒麻疹［3］、燙火傷。蠟梅花中主要含有氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、多糖、苷類、皂苷、有機(jī)酸、酚類、鞣質(zhì)、蒽醌、甾體、三萜、揮發(fā)油［4-9］、黃酮、香豆素［10］、油脂等物質(zhì)［11-15］。蠟梅花配方顆粒現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)依2018 年版《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》采用蠟梅花藥材為原料，按常規(guī)顆粒劑的方法制備。為此，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)蠟梅花進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，以建立該制劑可行的專屬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 - 2489 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；FK224型電子分析天平（南京伯尼塔科學(xué)儀器有限公司）；EX2252H/AD 型電子分析天平（美國(guó)Ohaus公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080-201811，含量為91.7%）；蠟梅花對(duì)照藥材（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為181010）；蠟梅花配方顆粒［仲景宛西制藥股份有限公司，批號(hào)分別為181101，181102，181103，規(guī)格為每袋1.5 g（相當(dāng)于飲片6 g）］；薄層板（青島海洋化工有限公司，規(guī)格為100 mm×100 mm）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

取樣品粉末約1 g，精密稱定，加乙醇30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；取蠟梅花對(duì)照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液；按蠟梅花配方顆粒處方及工藝，制備缺蠟梅花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（5.5∶3.5∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇- 1%冰醋酸溶液（32∶68，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2.2 溶液制備

1-3.供試品溶液 4.對(duì)照藥材溶液 5.陰性對(duì)照品溶液圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal materials solution 5.Negative reference solutionFig.1 TLC chromatograms

取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1.271 0 mg的對(duì)照品貯備液，取適量，稀釋為質(zhì)量濃度為0.127 1 mg/mL的對(duì)照品溶液；取樣品約0.5 g，加甲醇100 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；按蠟梅花配方顆粒處方及工藝制備缺蘆丁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下3 種溶液適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度>1.5，基線分離良好，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，2，5，8，10，15 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2 131 900X-39 295（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，蘆丁進(jìn)樣量在0.127 1～1.906 5 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.29%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品（批號(hào)為181101）溶液適量，室溫下放置0，2，4，6，8，12 h，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.45%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為181101）樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算蘆丁含量。結(jié)果的RSD為0.59%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為181101）粉末0.25 g，共6 份，置100 mL 容量瓶中，加對(duì)照品貯備液5 mL，再加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

1.蘆丁A.對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對(duì)照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.RutinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品各適量，分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果3批樣品中蘆丁含量分別為21.44，21.83，22.56 mg/g，平均21.94 mg/g。

3 討論

為提高檢測(cè)效率，預(yù)試驗(yàn)中對(duì)多項(xiàng)試驗(yàn)條件進(jìn)行了考察，最終得出相對(duì)較好的試驗(yàn)條件。溶劑方面，分別考察了采用甲醇、70%甲醇、50%甲醇為溶劑的檢測(cè)效果，發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑時(shí)提取效率最高，故本研究中選擇甲醇為溶劑。色譜柱方面，分別選擇Xtimate XB-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB - C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）及Agilent Zorbax SB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）對(duì)樣品有效成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果目標(biāo)成分均可有效分離且峰形良好，最終選擇的Agilent Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）出峰速度更快，有效節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間及試劑。流動(dòng)相方面，分別采用甲醇- 1%乙酸溶液、甲醇- 0.1%乙酸溶液、甲醇- 0.5%乙酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果采用甲醇-1%乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)分離效果最佳，故選擇。

綜上所述，本研究中所建立的方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于蠟梅花配方顆粒的質(zhì)量控制。隨著配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的執(zhí)行，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)不斷提高，考慮到中藥材不同基源產(chǎn)生的影響，為完善蠟梅花配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，下一步將建立其特征圖譜以進(jìn)一步研究。