微波輔助提取獼猴桃果渣總黃酮及其抗氧化活性

李金輝，翁貴英，朱淼，張澤敏，周曉玉，王緒英

（1．六盤水師范學院化學與材料工程學院，貴州 六盤水 553004；2．六盤水師范學院生物科學與技術學院，貴州 六盤水 553004）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch），又稱奇異果，俗稱毛桃、陽桃、山洋桃、毛梨桃等，為原產于中國的古老野生藤本果樹。獼猴桃不但含有豐富的維生素，還含有鈣、鉀、硒、鋅、鍺等微量元素和人體所需17種氨基酸，被譽為“水果之王”[1]。果渣與鮮果相比，雖然營養組分大量流失，但仍然含有較多的蛋白質、纖維素、維生素、黃酮類化合物和礦物質等營養成分[2]。黃酮類化合物具有較強的抗氧化性、抗炎抑菌、抗腫瘤、抗輻射、抗類風濕關節炎、免疫調節、預防保護心血管等作用，臨床上可用于治療腦供血不足、腦出血所致后遺癥、高黏脂血癥、腦血栓、冠心病、心絞痛等疾病，且能夠通過不同的信號通路調控自噬進而干預炎癥、肝病、心血管疾病、神經退行性疾病等慢性疾病[3-7]。

近年來有很多關于沙棘果渣、蘋果果渣、藍莓果渣、葡萄果渣、紅棗果渣以及刺梨果渣的研究，但未見獼猴桃釀酒果渣的相關研究[8-13]。貴州六盤水的紅心獼猴桃有“神奇美味果，紅色軟黃金”的美譽，獲得農業部“農產品地理標志”認證，國家質檢總局批準其為“國家地理標志保護產品”。本研究采用微波輔助技術提取獼猴桃釀酒發酵后的果渣中黃酮類化合物，采用響應面法設計優化提取工藝條件，并探索獼猴桃果渣總黃酮提取物的抗氧化活性[14-18]，為獼猴桃釀酒果渣“廢物再利用”，開發綠色、安全的天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃果渣（釀酒發酵后的果渣）：六盤水涼都獼猴桃產業股份有限公司；蘆丁標準品（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸：上海試四赫維化工有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：安徽酷爾生物工程有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉：成都金山化學試劑有限公司；硝酸鋁：天津科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇：上海國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901）、純水儀（New Human Power I）：北京普析通用儀器有限公司；常壓微波合成/萃取反應工作站（MAS-II型）：上海新儀微波化學科技有限公司；電熱鼓風干燥箱（101型）：北京科偉永興儀器有限公司；電子天平（ME104）：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；高速離心機（TG18K）：長沙東旺實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃果渣總黃酮提取工藝

將獼猴桃果渣于50℃干燥箱中烘至恒重，粉碎后過60目篩，置于聚乙烯樣袋密封保存備用。準確稱取一定量獼猴桃果渣，設置常壓微波合成/萃取反應工作站的微波功率為400 W，以1∶60（g/mL）的料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度、一定時間下進行提取，提取液在6 000 r/min離心10 min后取上清液，定容至50 mL，得到獼猴桃果渣總黃酮提取液。

1.2.2 總黃酮含量測定

準確稱取蘆丁標準品10 mg，用60%乙醇溶液定容至100 mL，得到濃度為100 μg/mL的蘆丁標準液。分別移取 100 μg/mL 蘆丁標準液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中；分別補充60%的乙醇溶液至5.0 mL；再加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，再搖勻，放置6 min后，加入4% NaOH溶液4.0 mL，最后用60%乙醇溶液定容，搖勻放置15 min。于510 nm處分別測定其吸光度，繪制蘆丁標準曲線，得到擬合線性方程：y=0.010 3x-0.000 8（R2=0.999 8）。移取獼猴桃果渣總黃酮提取液1 mL，按蘆丁標準曲線方法步驟操作，根據下式計算獼猴桃果渣總黃酮提取率[19]。

式中：C為總黃酮質量濃度，μg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；M為獼猴桃果渣質量，g。

1.2.3 單因素試驗

將獼猴桃果渣分別按照以下3個單因素試驗進行總黃酮的提取：乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%，提取溫度60℃，提取時間15 min；提取溫度30、40、50、60、70、80 ℃，乙醇濃度 50%，提取時間 15 min；提取時間 5、10、15、20、25、30 min，提取濃度 50%，提取溫度60℃。以上試驗均固定料液比1∶60（g/mL），微波功率400 W。

1.2.4 響應面優化試驗

基于單因素試驗結果，以總黃酮提取率為響應值，選取乙醇濃度、提取溫度、提取時間為自變量，利用Design-Expert8.05b軟件進行響應面優化試驗，響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface experiment

1.2.5 抗氧化試驗

以DPPH·和ABTS+·清除率為指標考察獼猴桃果渣總黃酮的抗氧化活性[20]。

1.2.5.1 DPPH·清除能力測定

將獼猴桃果渣總黃酮提取物稀釋至不同濃度，每個濃度的樣品取1mL于比色管中，加入3mL50.0μg/mL的DPPH溶液，充分混合均勻后，在10℃避光條件下反應30 min，于517 nm處測定吸光度。根據下式計算獼猴桃果渣總黃酮的DPPH·清除率。

式中：As為樣品溶液與DPPH溶液混合液的吸光度；Ac為樣品溶液與無水乙醇混合液的吸光度；Ab為DPPH溶液與無水乙醇混合液的吸光度。

1.2.5.2 ABTS+·清除能力測定

稱取ABTS400.0mg，過硫酸鉀68.8mg，溶于100mL去離子水中，搖勻，10℃避光放置24 h后，作為ABTS母液。取適量ABTS母液，用95%乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.02，作為ABTS測定溶液，現配現用。將獼猴桃果渣總黃酮提取物稀釋至不同濃度，每個濃度的樣品取0.4 mL于比色管中，加入3.6 mL ABTS溶液，充分混合均勻后，在10℃避光條件下反應5 min，于734 nm處測定吸光度。根據下式計算獼猴桃果渣總黃酮的ABTS+·清除率。

式中：Ab為ABTS溶液與95%乙醇混合液的吸光度；As為樣品溶液與ABTS溶液混合液的吸光度。

1.3 數據處理

采用Excel 2016軟件處理數據并繪圖。采用Design-Expert8.05b軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同乙醇濃度對獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對總黃酮提取率的影響見圖1。續試驗。

圖1 乙醇濃度對獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from kiwi fruit residues

2.1.2 不同提取溫度對獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響提取溫度對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of extraction temperatureon the yield of total flavonoids from kiwi fruit residues

由圖1可知，乙醇濃度小于50%時，獼猴桃果渣總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而提高，可能是乙醇濃度的增加有利于黃酮類物質溶出；當乙醇濃度大于50%時，總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而降低，可能是溶劑的極性變小，導致黃酮類物質溶出量減少；乙醇濃度為50%時，獼猴桃果渣總黃酮提取率最高，為2.94%。因此，選擇乙醇濃度為40%、50%、60%進行后

由圖2可知，提取溫度小于60℃時，獼猴桃果渣總黃酮提取率隨提取溫度的升高而提高，可能因為提取溫度升高可加快分子擴散速率，從而促進黃酮類物質析出；當提取溫度大于60℃時，總黃酮提取率隨提取溫度的升高反而降低，可能是因為提取溫度過高會破壞部分黃酮類物質結構并促進其它非黃酮物質析出；提取溫度在60℃時，獼猴桃果渣總黃酮提取率最高，為2.96%。因此，選擇提取溫度為50、60、70℃進行后續試驗。

2.1.3 不同提取時間對獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響

提取時間對總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the yield of total flavonoids from kiwi fruit residues

由圖3可知，提取時間小于15 min時，獼猴桃果渣總黃酮提取率隨提取時間的延長而提高，這是由于提取時間短，黃酮類化合物未能充分溶出；當提取時間大于15 min時，總黃酮提取率隨提取時間的延長反而降低，這是由于提取時間過長，溶出的黃酮類化合物易分解，導致總黃酮提取率下降；提取時間為15 min時，獼猴桃果渣總黃酮提取率最高，為2.93%。因此，選擇提取時間為10、15、20 min進行后續試驗。

2.2 響應面法優化提取工藝條件

2.2.1 回歸模型的建立與分析

基于單因素試驗結果，采用Box-Behnken原理設計響應面試驗，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

通過Design-Expert8.05b對數據進行分析回歸擬合，得到回歸方程為Y=-14.654 75+0.268 25A+0.286 78B+0.187 65C+6.250 00×10-4AB+9.500 00×10-4AC-6.000 00×10-4BC-3.220 00×10-3A2-2.345 00×10-3B2-6.18000×10-3C2。對擬合方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該回歸模型P＜0.000 1差異極顯著，失擬項P=0.464 9，沒有顯著性差異，表明該回歸模型與真實值擬合度較高。模型中 B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2表現為差異極顯著，A表現為差異顯著，3個因素對獼猴桃果渣總黃酮提取率的影響大小順序為B＞C＞A，即提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度。

2.2.2 響應面圖與等高線圖分析

各因素交互作用對總黃酮提取率影響的等高線圖和響應面圖見圖4～圖6。

圖4 乙醇濃度和提取溫度交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of the interaction of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of total flavonoids

圖5 乙醇濃度和提取時間交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of the interaction of ethanol concentration and extraction time on the yield of total flavonoids

圖6 提取溫度與提取時間交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.6 Effects of the interaction of extraction temperature and extraction time on the yield of total flavonoids

由圖4～圖6可知，AB、AC、BC交互作用的各響應面坡度陡峭，等高線均呈橢圓形，說明他們之間的交互作用對獼猴桃果渣總黃酮提取率影響較大，與方差分析結果一致。

2.3 最佳提取條件的確定及驗證試驗

使用Design-Expert8.05b得到獼猴果渣總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度50.39%、提取溫度65.83℃、提取時間15.86 min，此條件下總黃酮提取率為3.03%。根據試驗操作的可行性，修正提取工藝條件為乙醇濃度50%、提取溫度66℃、提取時間16 min，進行3次平行試驗，得到獼猴桃果渣總黃酮平均提取率為3.02%，與預測值的相對標準偏差為0.33%。

2.4 獼猴桃果渣總黃酮提取物抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除能力

獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的DPPH·清除能力見圖7。

圖7 獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的DPPH·清除能力Fig.7 DPPH·scavenging abilities of total flavonoids from kiwi fruit residues and ascorbic acid

由圖7可知，獼猴桃果渣總黃酮提取物與VC對DPPH·的清除能力均隨濃度的增大而增強，在濃度小于30.16 μg/mL時，獼猴桃果渣總黃酮提取物DPPH·清除能力優于同濃度VC溶液，在濃度為30.16 μg/mL時，VC溶液DPPH·清除能力較獼猴桃果渣總黃酮提取物略高。

2.4.2 ABTS+·清除能力

獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的ABTS+·清除能力見圖8。

圖8 獼猴桃果渣總黃酮提取物和VC的ABTS+·清除能力Fig.8 ABTS+·scavenging abilities of total flavonoids from kiwi fruit residues and ascorbic acid

由圖8可知，獼猴桃果渣總黃酮提取物與VC對ABTS+·的清除能力隨濃度的增大而增強，獼猴桃果渣總黃酮提取物ABTS+·清除能力優于同濃度VC溶液，在濃度為12.08 μg/mL時，獼猴桃果渣總黃酮提取物的ABTS+·清除率為 97.36%，VC溶液ABTS+·清除率為31.71%。獼猴桃果渣總黃酮提取物對ABTS+·清除能力遠大于VC溶液。

3 結論

本試驗以獼猴桃釀酒發酵后的果渣為研究對象，采用微波輔助法提取總黃酮，在考察乙醇濃度、提取溫度、提取時間3個單因素基礎上，通過響應面法對獼猴桃果渣總黃酮提取工藝進行優化。獼猴桃果渣總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇濃度50%、提取溫度66℃、提取時間16 min。在此條件下，總黃酮提取率為3.02%。獼猴桃果渣總黃酮提取物對DPPH·、ABTS+·具有不同程度的清除作用。表明獼猴桃釀酒發酵后的果渣具有較好的抗氧化活性，可為獼猴桃果渣再利用提供一定的參考依據。