生菜多酚氧化酶的酶活特性及碳點對其抑制作用

李宏，李秋蘭，于麗娟，普紅梅，楊德志，李雪瑞，楊亞玲*

（1.云南省農業科學院農產品加工研究所，云南 昆明 650033；2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

生菜（Lactuca sativa L.）是葉用萵苣的俗稱，質地鮮嫩，清香可生食。生菜具有很高的營養價值，含有多種維生素和礦物質，其中萵苣素具有促進人體血液循環和催眠利尿的作用[1]。食用生菜能夠幫助消化，改善便秘[2]。生菜含水量較高，但收獲后水分容易蒸發，在貯藏、運輸過程中經常發生褐變、腐爛、葉片變黃等現象，不利于其長時間儲藏[3]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是在水果、蔬菜發生酶促褐變過程中的主要酶類[4]，其作為一種在自然界中分布廣泛的含銅末端氧化還原酶[5-6]，在氧氣存在下能催化鄰苯二酚氧化成鄰苯二醌[7]，醌與植物細胞內蛋白質、氨基酸等物質絡合或自身聚合，形成褐色或黑色多聚物醌類物質[8]。國內外關于抑制水果蔬菜PPO活性的研究較多，且已有抑制方法，如降低氧含量的物理方法和添加亞硫酸鹽類、含硫有機化合物、抗壞血酸等抑制劑的化學方法[9]。近年來有學者研究表明抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、檸檬酸對生菜PPO活性有抑制效果[10-11]。

碳點（carbon dots，CDs）是一類尺寸在10 nm以內的球形或類球形的納米粒子[13]。作為碳納米材料家族的新成員[14]，自2004年[15-16]發現以來，因其具有原料成本低、易于合成、水溶性好、表面易功能化、環境友善、優越的物化性質等特點[17-19]，引起了各行各界廣泛的關注。在生物熒光成像[20]、生物傳感[21]、化學分析[22]、光催化[23]等領域得到廣泛應用。這些特性與碳點表面的官能團的種類和數量密不可分。碳點表面的還原性基團—OH、—SH等的存在使碳點具備還原性能，使其可應用于PPO抑制。與常用PPO抑制劑相比，其安全性、抑制效果等都具備一定優勢。但碳點在PPO抑制劑方面的應用卻鮮有研究。

本文對生菜根莖中PPO進行粗提，研究其酶活特性，制備了 3種不同摻雜的碳點（S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs），研究了CDs對生菜PPO活性的抑制性能，提供了一種新的PPO抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生菜：市售。谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化銨、檸檬酸、磷酸氫二鈉、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、苯酚、鄰苯三酚、抗壞血酸、尿素、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉銅（ethylenediaminetetraacetic acid copper disodium salt，EDTACu-2Na）：阿拉丁試劑上海有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SX2-5-12馬弗爐：上海力辰邦西儀器科技有限公司；T-50.1 L砂芯溶劑過濾器（濾頭孔徑10 μm）：天津市津騰實驗設備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京通用分析儀器有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋：金壇市富華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 碳點合成

分別以谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化銨、乙二胺四乙酸二鈉銅為原料，采用水熱法[24-25]制備硫摻雜、溴摻雜、銅摻雜的碳點（S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs）。

將1.5 g谷胱甘肽溶解于100 mL蒸餾水中，待完全溶解后將溶液轉移到聚四氟乙烯內襯的反應釜中，再置于馬弗爐中，在200℃的溫度下反應8 h。反應結束后取出，自然冷卻至室溫。再使用砂芯溶劑過濾器加0.2 μm的濾膜真空抽濾，然后將溶液轉移至離心管中，在轉速為10 000 r/min條件下離心30 min。待離心結束棄掉下層沉淀，所得上清液即為S-CDs，制備好的溶液置于4℃下保存備用。

Br-CDs制備：稱取十六烷基三甲基溴化銨1.82 g和尿素0.606 g、甘氨酸0.75 g溶解于40 mL蒸餾水中，完全溶解后將溶液轉移到聚四氟乙烯內襯的反應釜中，再置于馬弗爐中，在200℃的溫度下反應8 h。冷卻后處理步驟與S-CDs一致。

Cu-CDs制備：稱取0.4 g乙二胺四乙酸二鈉銅，溶解于40 mL水中，加入0.1 g檸檬酸和100 μL乙二胺，溶解后轉移至聚四氟乙烯內襯的反應釜，于馬弗爐中200℃反應8 h。冷卻后處理步驟與S-CDs一致。

1.3.2 生菜PPO提取方法

參考胡金強等[11]的方法，對生菜根莖的PPO進行粗提。將新鮮的生菜根部迅速去皮，取25g樣品，加入50 mL磷酸緩沖液（4℃預冷，pH值為7，濃度50 mmol/L），制成勻漿，在4℃，轉速8 500 r/min的冷凍離心機上離心15 min，取上清液即為生菜PPO粗提液。

1.3.3 生菜PPO活性的測定

以0.3 mL鄰苯二酚（濃度為0.3 mol/L）為底物，取2.6 mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH值為6）與之混勻，加入0.1 mL的酶粗提液，40℃反應10 min，于420 nm處測定產物的吸光度，表示其活性大小。

1.3.4 底物專一性

在2.6 mL緩沖液（pH值為6.2）和0.1 mL酶粗提液的混合溶液中分別加入0.3 mL不同的酚（對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、苯酚，濃度均為0.3 mol/L）作為底物，混勻，在21℃條件下水浴加熱10 min，測定420 nm處吸光度。

1.3.5 反應pH值對生菜PPO活性的影響

配制不同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH值在4～8之間），各取2.6 mL于5支試管中，分別加入0.3 mL的鄰苯二酚和0.1 mL的生菜PPO粗提液，渦旋混勻后在21℃反應10 min，于420 nm處測定吸光度。

1.3.6 反應溫度對生菜PPO活性的影響

取2.6 mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH值為6）和0.3 mL的鄰苯二酚與0.1 mL的PPO混勻后，于不同溫度（4、10、20、30、40、50、60 ℃）下加熱 10 min，在420 nm處測定吸光度。

1.3.7 不同抑制劑對生菜PPO活性的影響

在2.6 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH值為6）、0.3 mL鄰苯二酚和0.1 mL酶粗提液的混合體系中分別加入0.5 mL質量濃度為1 mg/mL的檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs溶液。旋渦混勻后于40℃反應10 min，于420 nm處測定吸光度。以不加抑制劑時的酶活為對照，加抑制劑時的酶活與不加入抑制劑時的酶活的比值表示抑制效果，低于對照組（不加抑制劑）即相對活性小于100%表示有抑制效果。

2 結果與分析

2.1 碳點的結構表征

為了了解S-CDs的形貌及其結構特征，對碳點進行了透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）和傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）、X射線光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）表征，結果如圖1所示。

圖1 S-CDs的表征圖譜Fig.1 Characterization spectras of S-CDs

從圖1a中可以看出，合成的S-CDs呈球形，且粒徑均勻，分散性較好，粒徑分布大約為（2.8±0.4）nm。由圖1b可知，3 404 cm-1處左右的寬峰對應O—H、N—H的伸縮振動[26]；在 2 929、2 302 cm-1處的峰對應 C—H和 S—H 的伸縮振動；在 1 656、1 546、1 382、1 151 cm-1及 1 031 cm-1處的峰對應 C O、C C、C—N、C—S及C—O的伸縮振動[27]。結果表明了S-CDs表面—OH、—COOH、—NH2及—SH的存在。由圖1c可知，在285、400、532、164 eV 處有 4 個峰，分別對應于 C 1s、N 1s、O 1s、S 2p，證明了 S-CDs中 C、N、O 及 S 原子存在[28]。

2.2 底物專一性

不同類型的多酚氧化酶具有不同的底物特異性，為了研究生菜PPO的底物專一性，選取了單酚（苯酚）、二酚（鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚）、鄰苯三酚為底物，考察其催化活性和速率變化，在相同條件下以對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、苯酚為底物，經生菜PPO的催化氧化，在420 nm處測吸光度，結果如圖2所示。

圖2 生菜PPO對不同酚類底物的催化氧化Fig.2 Oxidation of different phenolic substrates under the catalysis of PPO from Lactuca sativa L.

研究結果表明，生菜多酚氧化酶不具有底物專一性。由圖2a可知，以鄰苯二酚為底物時產物吸光度最高，這表示在相同催化反應時間下，生菜PPO對鄰苯二酚的催化速度最快，這可從圖2b的結果得到證實。以對苯二酚和鄰苯三酚作為底物的酶促反應催化速率大約只是其速率的一半，而以間苯二酚和苯酚為底物時其催化氧化活性不明顯。證明以這5種酚類為底物，生菜PPO對鄰苯二酚的親和力和催化活性最高，所以選擇鄰苯二酚作為生菜PPO的主要氧化底物進行后續研究。

2.3 反應pH值對生菜PPO活性的影響

不同pH值條件下測定的PPO酶活性大小不同，室溫條件下，采用鄰苯二酚為底物測定不同pH值對生菜PPO酶活的影響，結果如圖3所示。

圖3 pH值對生菜PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH value on the PPO activity of Lactuca sativa L.

由圖3可知，酸堿度過強都會對生菜PPO的活性產生明顯的抑制，相對而言酸性對其活性的影響較大。當pH值為6時，生菜PPO的活性最強；當pH值小于6時，PPO活性減弱，這可能是因為PPO作為一種堿性蛋白質，在強酸性條件下會解離出配基Cu2+，繼而使酶失去活性；當pH值大于6時，PPO的活性隨著pH值的增加而降低，這可能是因為堿性條件下，PPO的配基Cu2+會以氫氧化銅的形式存在而沉淀，使得酶的活性降低[29]。該酶的最適pH值為6，在儲藏過程中應該控制環境的pH值在4左右來抑制酶促褐變。

2.4 反應溫度對生菜PPO活性的影響

反應溫度對于PPO活性有一定影響。為了研究生菜PPO的最適反應溫度，測試了不同反應溫度下生菜PPO對鄰苯二酚的催化反應程度，結果如圖4所示。

圖4 反應溫度對生菜PPO活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the PPO activity of Lactuca sativa L.

由圖4可知，隨反應溫度的升高，生菜PPO活性呈現出先上升后下降的趨勢。可以看出該酶的最適反應溫度為40℃，反應溫度小于40℃時，生菜PPO活性隨著反應溫度的升高而升高，這是因為反應溫度升高加快了反應速率；反應溫度大于40℃時，酶活性隨著反應溫度的升高而降低，這是因為高溫破壞了酶的結構，導致其活性部位完整性的損壞，從而使酶失去活性[30-32]。

2.5 抑制劑篩選

3種常用于水果蔬菜保鮮中PPO的抑制劑以及實驗室合成的3種摻雜碳點，對于生菜PPO活性抑制的效果如圖5所示。

圖5 不同抑制劑對生菜PPO活性的影響Fig.5 Effect of inhibitor on PPO activity of Lactuca sativa L.

由圖5可知，S-CDs的生菜PPO抑制效果最好，抗壞血酸效果僅次于S-CDs，檸檬酸再次之，Cu-CDs抑制效果較差，而Br-CDs以及半胱氨酸對生菜PPO活性并無明顯抑制。這可能是因為抗壞血酸可作醌的還原劑，又可以作為銅離子的螯合劑，可將酶絡合的Cu2+還原為Cu+，從而抑制酶活性[33]；檸檬酸通過降低反應體系的酸堿度來抑制酶活性[34]；而S-CDs表面的—OH、—SH及—NH2與多酚氧化酶的輔基Cu2+螯合，起到競爭性抑制作用。由圖5b～5d可以看出，在濃度均為0.1 mg/mL時，在S-CDs作用下生菜PPO的活性只有55%，而抗壞血酸和檸檬酸作用下，其活性分別為57%和78%；當濃度到達0.3 mg/mL時，而在檸檬酸和抗壞血酸作用下，生菜PPO活性分別還剩下30%和20%，而在S-CDs作用下，生菜PPO活性僅為10%。這些結果再一次證明S-CDs對生菜PPO具有較強的抑制效果。

3 結論

生菜的褐變與生菜PPO的催化活性有著不可分割的關系，了解PPO的特性旨在更好的控制酶促褐變的發生。本研究初步考察了不同底物、不同pH值和不同溫度對PPO活性的影響。研究結果表明，生菜PPO的主要氧化底物是鄰苯二酚，并且以鄰苯二酚作為底物，得到該酶的最適緩沖液pH值為6，最適溫度為40℃。通過水熱法合成3種不同摻雜的碳點，與3種常用PPO抑制劑進行比較發現：檸檬酸、抗壞血酸、Cu-CDs、S-CDs均能有效抑制生菜PPO活性，其中SCDs及抗壞血酸抑制生菜PPO活性的效果最佳，這可能是由于S-CDs表面含有的還原性—OH、—SH及—NH2對生菜PPO產生好的抑制效果，這區別于其他CDs和常規抑制劑，且當S-CDs濃度為0.3 mg/mL時，生菜PPO已基本失活。