石蒜屬種間雜交種的鑒定和分子身份證構建

王 黎，周 琪，高燕會

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

石蒜屬Lycoris植物隸屬百合目Liliflorae石蒜科Amaryllidaceae，具地下鱗莖，為多年生草本植物；全球約有20多種，中國有15種，主要分布在江蘇、浙江和安徽等地[1]。石蒜屬植物花型花色變異豐富，種間雜交親和性高，對石蒜屬植物進行遺傳育種改良，極有希望選育出有中國特色的切花新品種[2]，市場前景和園林應用前景極為廣闊。同時，石蒜鱗莖富含生物堿、黃酮及多糖等化學成分，藥用價值較高[3-4]。目前，石蒜屬植物新品種選育主要通過種間和種內雜交、自然群體選擇，對其雜交種真實性的鑒定主要根據開花時花色和花型等農藝性狀的變化來判斷；但由于石蒜屬植物生長周期長，種子播種后5～6 a才開花，早期鑒定及分類較為困難，從而影響銷售和生產。

常用的雜種鑒定方法有形態標記法、生化標記法和DNA標記法等。形態標記耗時費力，易受環境條件和檢測人員主觀判斷的影響；生化標記數目少且穩定性差，不能進行多年生植物雜交種的早期鑒定，無法滿足生產和市場的需求；相比之下，DNA標記簡單序列重復(SSR)、目標起始密碼子多態性(SCoT)、內部簡單序列重復(ISSR)、相關序列擴增多態性(SRAP)和熒光標記SSR能反映生物個體或種群間某些特異性DNA片段，不受生物自身生長階段和環境條件的影響，標記數量較多，重復性好，開發成本低，不影響性狀表達[5-7]，已在冬瓜Benincasa hispida[8]、甜菜Beta vulgaris[9]、姜黃屬 Curcum植物[10]、枇杷Eriobotrya japonica[11]等種質資源遺傳多樣性、雜交種鑒定、品種鑒定和分子身份證的構建等方面得到廣泛應用。其中SSR標記是以PCR技術為基礎、較成熟的遺傳標記，但由于工作量大、精度低、分析量小，無法完成大批量樣品的檢測，而熒光標記SSR能準確獲得目標DNA片段的大小(精確至1 bp)，檢測結果穩定、準確且高效適用于大批量品種的檢測分析，已被應用于落花生Arachis hypogaea[12]、高山杜鵑 Rhododendron lapponicum[13]、百合屬 Lilium[14]、芒 Miscanthus sinensis[15]等 F1代雜交種真實性和純度檢測、遺傳多樣性分析、核心種質的構建等。石艷等[16]開發了石蒜屬植物換錦花L. sprengeri的表達序列標簽SSR(EST-SSR)標記，用于鑒定換錦花-中國石蒜L. chinensis雜交種，為石蒜屬種間雜交種F1的鑒定提供了借鑒。為進一步完善石蒜屬植物種間雜交種F1的鑒定技術，本研究篩選了15對EST-SSR引物，通過EST-SSR熒光標記毛細管電泳技術構建親本換錦花、石蒜L. radiata、中國石蒜以及石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種等78個樣品的分子身份證，并進行雜交種真實性鑒定，為石蒜屬植物的親緣關系分析、品種選育、雜交種早期鑒定及資源保護和利用等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

石蒜、中國石蒜、換錦花及石蒜-中國石蒜、石蒜-換錦花雜交種F1共78個樣品，均栽植于浙江農林大學石蒜屬種質資源圃，于2020年8—9月盛花期采集各材料花瓣。

1.2 基因組 DNA 提取和 EST-SSR 引物篩選

采用改良CTAB法提取供試材料花瓣基因組DNA，用Nanodrop 2000測定DNA的質量和濃度，經質量濃度為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統拍照。

分別以親本(中國石蒜、石蒜和換錦花)基因組DNA為模板，從59對石蒜屬植物通用EST-SSR引物中篩選條帶清晰、重復性好且具多態性的引物進行擴增[16]。EST-SSR PCR擴增反應體系(10.0 μL)為：Taq DNA 聚合酶 1.0×16.67 nkat，氯化鎂 (MgCl2) 1.0 mmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，引物 0.8 μmol·L-1，DNA 40 ng。PCR 反應程序為 94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 變性 30 S，退火溫度 30 S，72 ℃ 延伸 30 S，35次循環；72 ℃延伸10 min；16 ℃保溫30 min。用質量濃度10.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染顯色檢測擴增反應產物，顯色后記錄觀察拍照。

1.3 熒光標記EST-SSR毛細管電泳和雜交種鑒定

從59對多態性引物中篩選到15對具多態性的EST-SSR引物(表1)，在正向引物中分別加注FAM(藍)、HEX (綠)、TAMRA (黃)和 ROX (紅)熒光，對78個樣品進行多重 PCR 擴增。利用遺傳分析儀(ABI 3730XL，ThermoFisher Scientific，美國)進行毛細管電泳檢測分析。根據電泳結果，選擇在親本(中國石蒜、石蒜和換錦花)種內一致、種間具多態性、特異、單一且重復性好的引物用于雜交種鑒定。比較親本與雜交種F1的 EST-SSR PCR擴增產物，雜交種F1具有父母本互補型或有變異型擴增帶型的樣品鑒定為真實雜種。計算雜交種鑒定率=真實雜交種樣本數/樣本總數×100%。

表1 15對 EST-SSR 引物序列和 PCR 產物Table 1 Sequences and PCR products of 15 pair of SSR primers

1.4 數據統計分析與分子身份證構建

利用Gene mapper 4.1軟件整理分析EST-SSR熒光標記的毛細管電泳數據，根據每個引物對每個樣品擴增后有無峰，轉化成0/1格式的二元矩陣，無信號或數據缺失賦值“2”。利用POPgene 1.32計算觀測等位基因數(Na)，有效等位基因數(Ne)，Nei’s基因遺傳多樣性指數(H)，Shannon’s指數(In)和多態性信息量(PIC)。使用NTsys2.10e計算石蒜屬親本及雜交種的Nei’s 遺傳距離和SM遺傳相似系數，并用非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析。

參照徐雷峰等[14]方法將獲得的熒光標記EST-SSR多態性數據轉換為數字(1～9)表示，當基因型數大于9時，用小寫字母(a、b、c、 ···)依次表示，無帶用0表示。按照引物擴增帶型數由少到多的順序，記錄各樣品在15對引物上的擴增帶型數據，通過個位數字或小寫字母編碼構建各雜交種的分子身份證。

2 結果與分析

2.1 親本特異型 EST-SSR 引物的篩選

熒光毛細管電泳檢測發現：15對引物在25個樣品中均能獲得大小精確的DNA片段，篩選其中具有種內一致性且種間多態性的4對引物。由表2可知：SSR203和SSR15在3個親本中均能得到特征條帶，SSR32可在石蒜和中國石蒜中得到特征條帶，SSR198可在石蒜和換錦花中得到特征條帶。因此SSR203、SSR115和SSR198用來鑒定石蒜-換錦花雜交種(包括正交和反交)的真實性，SSR203、SSR115和SSR32可鑒定石蒜-中國石蒜雜交種的真實性。

表2 4個熒光標記 EST-SSR 引物在石蒜屬親本上的特征條帶Table 2 Characteristic bands of 4 fluorescent labeled EST-SSR primers on the parents of Lycoris

2.2 雜交種 F1 代的鑒定

利用SSR203、SSR115和SSR198對27個石蒜-換錦花雜交種F1代進行鑒定。由表3可知：SSR203從石蒜-換錦花雜交F1后代群體中鑒定到88.46%的真實雜交種，其中具有雙親特征條帶(189/204 bp)的占69.23%，出現特異條帶的有19.23%；SSR115從石蒜-換錦花雜交種F1群體中鑒定到84.61%的真實雜交種，其中具有雙親特征條帶的占53.85%，出現特異條帶的占30.77%；SSR198只鑒定到53.85%的真實雜交種。分別利用SSR203+SSR115、SSR203+SSR115+SSR198進行多重PCR，從石蒜-換錦花正反交F1雜交群體中均鑒定到96.30%的真實雜交種，大于SSR203+SSR198 (88.89%)和SSR115+SSR198(88.89%)組合的鑒定結果。因此采用SSR203+SSR115和SSR203+SSR115+SSR198可以早期鑒定石蒜-換錦花雜交種F1的真實性。

表3 EST-SSR 引物對石蒜屬種間雜交種鑒定Table 3 Identification of interspecific hybridization of Lycoris by EST-SSR primers

同樣，利用引物SSR203、SSR115和SSR32對石蒜-中國石蒜雜交種F1進行鑒定。SSR203鑒定石蒜-中國石蒜雜交種F1的真實雜交種占80.77%，其中具有雙親特征條帶(175/169 bp)的占42.31%，具變異條帶的有38.46%；SSR115和SSR32鑒定石蒜-中國石蒜雜交種F1群體的真實性分別為50.00%和69.23%。采用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SR203+SSR115+SSR32多重PCR擴增，石蒜-中國石蒜雜交種F1群體的真實雜交種鑒定效率均達96.15%，高于SSR115+SSR32鑒定效率(76.92%)。因此可用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SSR203+SSR115+SSR32對石蒜和中國石蒜雜交種真實性進行鑒定。

為節省成本，縮短育種周期和減少工作量，本研究采用SSR203+SSR115對石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種F1代進行早期鑒定。

2.3 雜交種遺傳多樣性分析

2.3.1 引物多態性分析 篩選出的15對熒光標記EST-SSR引物在78個樣品中擴增效果較好(表4)，共得到擴增條帶92條，擴增條帶最多的是SSR32 (10條)，最少的是SSR21 (2條)，平均6.13條。多態性信息量 (PIC)為 0.692 3～1.000 0，其中 SSR253 最小 (0.692 3)，SSR20 和 SSR142 最高 (1.000 0)，平均為0.913 7。所有PIC值均大于0.500 0，說明均為高多態性引物，可反映雜交種間遺傳差異和遺傳多樣性。

2.3.2 石蒜屬種間雜交種的遺傳多樣性分析 以15對熒光標記EST-SSR標記擴增結果計算遺傳相似系數并進行UPGMA聚類分析。由圖1可知：各樣品遺傳相似系數為0.76～0.98，在相似系數為0.77處25個親本和53個雜交種聚為Ⅰ和Ⅱ兩大類，Ⅰ類主要為換錦花、石蒜-換錦花雜交種，但包含了58、60、61、64和66等石蒜-中國石蒜雜交種，且與石蒜-換錦花雜交種聚在一起，推測5個雜交種的母本可能是石蒜。Ⅱ類包括Ⅱa(石蒜)、Ⅱc(中國石蒜)、Ⅱb(中國石蒜-石蒜雜交種)等3個亞類，說明本研究所用的15對熒光標記EST-SSR可用作石蒜、中國石蒜、換錦花及種間雜交種的早期鑒定。

圖1 基于熒光標記EST-SSR的石蒜屬親本和雜交種的聚類圖Figure 1 Cluster diagram of Lycoris parents and hybrids based on EST-SSR

2.4 種間雜交種 F1 的分子身份證編碼

由表5可知：15對熒光標記EST-SSR引物擴增各樣品，共得到153種帶型，平均每條擴增10.2帶型，其中SSR221擴增帶型最少(2種)，SSR32擴增帶型最多(30種)。根據表4對15對熒光標記ESTSSR引物擴增得到的基因型或帶型賦值并排序，以此對各樣品的擴增情況編碼分子身份證，擴增條帶位置相同則編碼符號相同，說明基因型相同。由表6可知：各親本和各雜交種均具有唯一的分子身份證，15對熒光標記EST-SSR引物可有效鑒別石蒜屬親本和種間雜交種。

表4 EST-SSR引物擴增條帶的等位基因數和多態性信息量Table 4 Number of alleles and polymorphism information of 15 EST-SSR primers

表5 15 對熒光標記EST-SSR引物在親本及雜交種F1上的擴增帶型Table 5 Amplification patterns of 15 pairs of fluorescent labeled EST-SSR primers on parents and hybrid F1

表6 石蒜、中國石蒜、換錦花及種間雜交種分子身份證代碼Table 6 Molecular ID codes of parent L. radiata， L. chinensis， L. sprengeri and interspecific hybrids

3 結論與討論

SSR熒光標記在毛白楊Populus tomentosa[17]和建蘭Cymbidium ensifolium[18]等核心種質構建、落花生[12]和山茶屬Camellia植物[19]等分子身份證構建以及三葉青Tetrastigma hemsleyanum[20]、雜交蘭[21]等種質資源遺傳多樣性研究中得到驗證。本研究表明：利用熒光標記EST-SSR檢測石蒜屬各親本及雜交種的真實性、分析其間遺傳關系，精準高效，結果可靠。

本研究利用15對熒光標記EST-SSR引物從石蒜、中國石蒜、換錦花和種間雜交種共78個樣品中擴增到92個條帶，平均每對引物6.13條；15對ESR-SSR引物多態性信息量均大于0.500 0，平均為0.913 7，較好地反映了雜交種間的遺傳差異和遺傳多樣性，與茶Camellia sinensis[22]、百合[14，23]等的研究結果類似。利用熒光標記EST-SSR引物鑒定石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種F1代，發現SSR203+SSR115等引物對雜交種鑒定的真實性分別達96.30%和96.15%，與SSR203+SSR115+SSR198和SSR203+SSR115+SSR32等引物鑒定結果相同，因此用SSR203+SSR115引物對石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種F1進行鑒定，可大大縮短育種周期，減少工作量并節約成本。

分子身份證構建以 DNA 指紋圖譜為基礎，是識別種質資源的標志，可以更加簡單明了地識別和檢索種質資源[24]。本研究利用15對熒光標記EST-SSR引物共擴增出92個條多態性條帶，153種帶型，按照統計方便、書寫簡潔、字符串長短適中、易于檢索及充分利用引物的原則，采用基因型賦值編碼法[14]對石蒜屬親本和雜交種單一位點帶型或雜合帶型進行編碼，構建石蒜屬植物親本和雜交種的分子身份證，較好地區分了78份石蒜屬植物材料，說明該方法適用于石蒜屬植物的鑒定。

以RAPD、ISSR和SCoT等分子標記技術分析石蒜屬植物種質資源的遺傳多樣性，建立遺傳距離和遺傳相似系數矩陣，構建相應分子樹狀圖和指紋圖譜[2，25-26]，其目的主要是為了雜交種的親本配制、野生資源的高效利用等。本研究利用15對熒光標記EST-SSR引物擴增了78個石蒜屬植物的遺傳物質，發現各樣本遺傳相似系數為0.76～0.98；UPGMA聚類分析發現：相似系數為0.77時，25個親本和53個雜交種聚為兩大類，Ⅰ類包括親本換錦花、石蒜-換錦花的雜交種，Ⅱ類又分為Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc 等3個亞類，包括石蒜、中國石蒜-石蒜雜交種和中國石蒜，說明15對熒光標記EST-SSR可將石蒜、中國石蒜、換錦花及種間雜交種有效聚類，結合雜交種的遺傳多樣性認為：熒光標記EST-SSR可有效鑒定石蒜屬雜交種F1，并厘清其間的遺傳關系。