無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中生理指標變化規(guī)律

韓衛(wèi)娟，刁松鋒，張 悅，2，傅建敏，李華威，孫 鵬，索玉靜，李芳東

（1. 中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究所 經(jīng)濟林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，河南 鄭州450003；2. 南京林業(yè)大學 林學院，江蘇 南京 210037）

君遷子Diospyros lotus果實又名黑棗、軟棗，為柿科Ebenaceae柿屬Diospyros落葉喬木，分為有核和無核2個大類[1-2]。無核君遷子果實可食率高，硬熟期果皮呈淺黃色，軟熟期果皮呈黃褐色，后呈黑色，主要分布在河南、河北、山東、陜西、山西等中西部地區(qū)，具有肉厚味甜、風味獨特、質(zhì)地細嫩、果汁少、口感好、耐儲藏運輸?shù)葍?yōu)良特性[2-3]，鮮果富含維生素C、維生素A、碘、果膠、膳食纖維等[4]。黑棗具有止渴，去煩熱，令人潤澤等功效，為“五黑固腎粥”的主要配方之一[5-6]。因此，無核君遷子為藥食同源果品，除鮮食外，可加工成棗面、黑棗酒、黑棗醋等，開發(fā)價值高，市場潛力巨大。

果實質(zhì)地、糖含量、糖酸比和黃酮、酚類、單寧等活性物質(zhì)，是果實內(nèi)在品質(zhì)的重要組成部分，對果實的鮮食和加工品質(zhì)均有重要影響[7-9]。其中，質(zhì)地變軟是果實發(fā)育成熟最明顯的標志，是果實采收和品質(zhì)評價的重要指標[10]。無核君遷子果實因其獨特的風味和食療保健價值而深受消費者喜愛，但目前關(guān)于無核君遷子的研究主要集中在栽培技術(shù)、粗加工技術(shù)等方面[11-13]，關(guān)于發(fā)育成熟軟化過程中生理指標變化規(guī)律的研究尚未見報道。

本研究以不同時期無核君遷子果實為研究對象，測定其單寧、黃酮、總酚、花青素、糖、果膠組分以及果膠降解酶活性，從果實發(fā)育、成熟、軟化全過程對果實內(nèi)在品質(zhì)變化進行了系統(tǒng)研究，并對其相關(guān)性進行分析，以期為無核君遷子果實的深入開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究所選育的‘無核1號’ ‘Wuhe 1’果實，試驗基地位于河南省新鄉(xiāng)市原陽縣原武鎮(zhèn)靳屋村 (34°55′30″～34°56′45″N，113°46′24″～113°47′59″E)。選擇樹勢健壯、無病蟲害的無性系單株10株，從花后約5周至花后27周的6個時期，即2020年6月15日(幼果期)、7月15日(膨大期)、8月15日(青果期)、9月15日(轉(zhuǎn)色期)、10月15日(初熟期)和11月15日(軟熟期)，在樹冠中部外圍，按東、南、西、北4個方向采樣，每個方向采集果實5個，混合均勻后低溫冷藏帶回實驗室，冰水沖洗后用紗布吸干表面水分，切碎經(jīng)液氮速凍于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于相關(guān)指標測定。

1.2 方法

1.2.1 單寧測定 可溶性單寧和不溶性單寧測定采用Folin-Ciocalteu法，參考余軒[14]的方法，以單寧酸為標準品，測定725 nm處的吸光度。

1.2.2 總酚、黃酮和花青素測定 總酚測定采用 Folin-Ciocalteu 法[15]，以沒食子酸為標準品，測定 760 nm處的吸光度；黃酮測定采用三氯化鋁(醋酸-醋酸鈉)顯色法測定[15]，以蘆丁為標準品，測定400 nm處的吸光度；花青素測定采用曹建康等[16]的方法，以530 nm處的吸光度D(530)和600 nm處的吸光度D(600)的差值D花青素表示花青素含量。

1.2.3 淀粉、糖組分及可滴定酸測定 淀粉采用蒽酮比色法測定[16]，以葡萄糖為標準品，測定620 nm處的吸光度。糖組分的提取方法參照杜改改等[17]的方法并稍作改進。精密稱取試驗材料中無核君遷子果肉1.000 g，5 mL蒸餾水沸水提取30 min，冰水中冷卻后10 000 g離心20 min，收集上清液。在濾渣中再次準確加入5 mL蒸餾水，重復提取1次，合并2次上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾后上機測定。糖組分檢測參照GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》，色譜柱為CNW Athena NH2-RP(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，柱溫為 40 ℃，流動相為體積分數(shù) 75% 的乙腈水溶液，流速為 1.0 mL·min-1，檢測器為Waters 2 414示差折光檢測器，根據(jù)峰面積和標準曲線計算果糖、葡萄糖、蔗糖的質(zhì)量分數(shù)。可滴定酸采用酸堿滴定法[16]測定。糖酸比由可溶性糖質(zhì)量分數(shù)與可滴定酸質(zhì)量分數(shù)的比值計算。

1.2.4 果膠組分質(zhì)量分數(shù)及果膠降解酶活性的測定 參考齊秀東等[10]的方法，進行水溶性果膠、離子結(jié)合果膠、共價結(jié)合果膠的提取，以半乳糖醛酸為標準，用咔唑比色法測定各果膠組分。

多聚半乳糖醛酸酶的提取和測定參考REN等[18]的方法并加以改進，多聚半乳糖醛酸酶活性以每小時每克樣品在37 ℃催化半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，單位為mg·g-1·h-1；果膠裂解酶的提取和測定參考ZHI等[19]的方法并加以改進，果膠裂解酶活性定義為每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1 nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為1個酶活力單位，單位為16.67 nkat·g-1·min-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel軟件計算各指標的平均值、標準差、線性回歸方程等；利用SPSS 20.0進行方差分析、Duncan多重比較(顯著性水平為0.05)、Pearson相關(guān)性分析，利用Excel和GraphPad Prism 6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中單寧質(zhì)量分數(shù)的變化

如圖1所示：無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中可溶性單寧質(zhì)量分數(shù)隨著果實的發(fā)育成熟不斷降低，果實軟熟期降至(0.75±0.23) mg·g-1，低于可食用閾值(2.00 mg·g-1)[20]，口嘗無澀味；不溶性單寧質(zhì)量分數(shù)隨著果實成熟過程逐漸上升，軟熟期上升至(21.63±0.94) mg·g-1，這可能與果實脫澀過程中可溶性單寧向不溶性單寧的轉(zhuǎn)化有關(guān)[21]。

圖1 果實發(fā)育成熟過程中可溶性單寧和不溶性單寧的變化Figure 1 Changes of soluble tannin and insoluble tannin contents during fruit development and ripening

2.2 無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中總酚、黃酮和花青素質(zhì)量分數(shù)的變化

如圖2A和圖2B所示：無核君遷子果實在幼果期和膨大期，果實中黃酮和酚類物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)較低，8月中旬青果期最高，后隨著果實的成熟軟化逐漸降低。花青素如圖2C所示：幼果期最高，初熟期最低，其他時期花青素無顯著性差異。

圖2 果實發(fā)育成熟過程中總酚 (A)、黃酮 (B)和花青素 (C)的變化Figure 2 Changes of total polyphenols (A)， flavonoids (B)， and anthocyanin (C) contents during fruit development and ripening

2.3 無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中淀粉、糖組分及可滴定酸質(zhì)量分數(shù)的變化

由表1可知：無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中淀粉逐漸積累，呈顯著上升趨勢(P＜0.05)，果實軟熟期淀粉質(zhì)量分數(shù)高達 (56.70±3.60) mg·g-1。無核君遷子果實中果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)呈相似的增加趨勢，在6—7月，葡萄糖質(zhì)量分數(shù)高于果糖，8月后果糖質(zhì)量分數(shù)高于葡萄糖。根據(jù)甜度值計算方法，定義蔗糖甜度為100，則果糖為175，葡萄糖為75[22]。由此可知，8月后由于果糖質(zhì)量分數(shù)增加且超過葡萄糖，無核君遷子果實甜度呈增加的趨勢。蔗糖在7月中旬后的樣品中未檢出，無核君遷子果實可溶性糖以葡萄糖和果糖為主，因此其糖積累類型為己糖積累型。無核君遷子可滴定酸呈先升后降的變化趨勢，在7月中旬達到峰值后隨著果實成熟度的增加而下降，導致酸味顯著降低。糖酸比呈逐漸上升的變化趨勢，糖酸比越高果實甜度越大，說明果實甜味隨著發(fā)育成熟逐漸增加。

表1 淀粉、可溶性糖、可滴定酸和糖酸比在果實發(fā)育成熟過程中的變化Table 1 Changes of soluble starch， soluble sugar， titratable acid and sugar-acid ratio during fruit development and ripening

2.4 無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中果膠組分和果膠降解酶活性的變化

無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中水溶性果膠和離子結(jié)合果膠質(zhì)量分數(shù)呈上升的變化趨勢(圖3A和圖3B)，均在果實軟熟期質(zhì)量分數(shù)最高，分別為(10.59±0.39)、(5.21±0.13) mg·g-1。由圖3C可知：共價結(jié)合果膠質(zhì)量分數(shù)呈先上升后下降的變化趨勢，果實軟熟期則顯著下降(P＜0.05)。如圖4所示：無核君遷子果實發(fā)育成熟期間多聚半乳糖醛酸酶活性在6—8月逐漸下降，8月后活性逐漸上升，在果實軟熟期活性最高，為(20.39±0.18) mg·g-1·h-1；果膠裂解酶活性在果實軟熟期顯著升高(P＜0.05)，為(230.48±15.59)×16.67 nkat·g-1·min-1。

圖3 果實發(fā)育成熟過程中水溶性果膠(A)、離子結(jié)合果膠(B)和共價結(jié)合果膠(C)的變化Figure 3 Changes of water soluble pectin (A)， ironic soluble pectin (B) and covalent soluble pectin (C) contents during fruit development and ripening

圖4 果實發(fā)育成熟過程中多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶活性的變化Figure 4 Changes of polygalacturonase and pectate lyase activity during fruit development and ripening

2.5 無核君遷子果實各生理指標相關(guān)性分析

相關(guān)性分析(表2)表明：無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中，可溶性單寧與總酚、黃酮和可滴定酸呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與不溶性單寧、淀粉、果糖、葡萄糖、糖酸比、水溶性果膠、離子結(jié)合果膠以及多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，說明無核君遷子可溶性單寧在果實發(fā)育成熟過程中逐漸轉(zhuǎn)化為不溶性單寧，其轉(zhuǎn)化過程可能與糖組分和細胞壁組分的變化有關(guān)。總酚、黃酮與不溶性單寧、淀粉、果糖、葡萄糖、糖酸比、水溶性果膠、離子結(jié)合果膠以及多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，與可溶性單寧、共價結(jié)合果膠呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；花青素與果糖呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)；淀粉、果糖、葡萄糖均與糖酸比、水溶性果膠、離子結(jié)合果膠及多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與可滴定酸呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，說明無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中，在果膠降解酶的參與下，細胞壁果膠組分降解，進而導致果實軟化、可溶性糖升高以及活性成分變化；隨著果實的發(fā)育成熟，可溶性糖上升，可滴定酸下降，從而引起果實糖酸比逐漸上升，果實甜度增加。果實水溶性果膠與離子結(jié)合果膠呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，水溶性果膠和離子結(jié)合果膠均與多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；共價結(jié)合果膠與多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)；多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶活性呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，說明多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶參與了無核君遷子果實的軟化過程，這與果膠降解、細胞壁結(jié)構(gòu)解體有關(guān)。

表2 無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中各指標的Pearson相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation coefficients analysis of seedless D. lotus fruit

3 結(jié)論與討論

果實是植物儲藏淀粉的重要器官之一。本研究表明：淀粉在無核君遷子果實生長發(fā)育期間逐漸積累，果實成熟后淀粉質(zhì)量分數(shù)高達(56.70±3.60) mg·g-1。田娟等[23]對22份不同地區(qū)火棘Pyracantha果實淀粉質(zhì)量分數(shù)的研究表明：僅有2份資源淀粉的質(zhì)量分數(shù)高于(56.70±3.60) mg·g-1。由此可知：成熟的無核君遷子果實中淀粉質(zhì)量分數(shù)較高，具有潛在的開發(fā)利用價值。可溶性糖是水果中的重要營養(yǎng)成分，其種類和構(gòu)成比例在很大程度上影響果品的甜度和口感[24]。本研究表明：無核君遷子果實中以葡萄糖和果糖為主，糖積累類型為己糖積累型；葡萄糖在果實發(fā)育早期高于果糖，后期低于果糖，由于果糖甜度高于葡萄糖，這是果實成熟過程中甜度逐漸增加的主要原因。

多酚和黃酮是植物中廣泛存在的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等保健作用。無核君遷子果實總酚和黃酮質(zhì)量分數(shù)在8月中旬最高，此時是提取多酚、黃酮類物質(zhì)的最佳采收時期。花青素是一類生物活性極強的可溶性黃酮類物質(zhì)，除具有防治心血管疾病、抗高血壓、降血脂、降血糖、抗癌等活性[25-26]外，也是決定果實色澤的主要色素。本研究表明：無核君遷子花青素在果實發(fā)育初期最高，隨后下降，果實軟熟期略有回升，但決定無核君遷子發(fā)育過程中顏色變化的花青素種類和質(zhì)量分數(shù)有待深入研究。

根據(jù)柿Diospyros kaki單寧在醇中溶解性的不同，分為可溶性單寧和不溶性單寧2類，柿果實澀味主要是由可溶性單寧引起的[27]。本研究表明：無核君遷子果實發(fā)育成熟過程中可溶性單寧不斷下降，軟熟期降至可食用閾值以下，同時也伴隨著不溶性單寧逐漸上升的過程。有關(guān)澀柿脫澀單寧聚合的研究可歸結(jié)為縮合學說和凝膠學說[28]，膠凝學說認為可溶性單寧在脫澀過程中與果肉中的果膠、多糖發(fā)生膠凝反應，形成凝膠，澀味消失。本研究表明：可溶性單寧與不溶性單寧、淀粉、果糖、葡萄糖、水溶性果膠、離子結(jié)合果膠以及多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，這說明無核君遷子果實脫澀過程不僅存在單寧縮合效應，還存在單寧縮合與凝膠綜合作用。

果膠主要起著粘連細胞的作用，與果實質(zhì)地密切相關(guān)[10]。研究表明：果膠在果實成熟之前呈不溶狀態(tài)，隨著果實成熟軟化逐步降解，使果膠的平均分子質(zhì)量和果膠多糖交聯(lián)能力下降，細胞結(jié)構(gòu)隨之受損，導致果實軟化[24]。而這些過程往往伴隨著果膠降解酶，如多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶等的參與，它們通過降解果膠多糖組分，使細胞間連接減少，細胞離散而參與果實質(zhì)地軟化，且在果實軟化的不同階段起不同的作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)：水溶性果膠和離子結(jié)合果膠質(zhì)量分數(shù)呈上升的變化趨勢，共價結(jié)合果膠質(zhì)量分數(shù)呈先上升后下降的變化趨勢。齊秀東等[10]對秋子梨‘京白梨’Pyrus ussuriensis‘Jingbaili’發(fā)育軟化與果膠的關(guān)系研究表明：水溶性果膠和離子結(jié)合果膠逐漸增加，而共價結(jié)合果膠先升后降；羅自生[29]對柿果實軟化過程中細胞壁組分的研究表明：水溶性果膠質(zhì)量分數(shù)逐漸增加。這些均與本研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析表明：無核君遷子果實水溶性果膠、離子結(jié)合果膠與多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，共價結(jié)合果膠與多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)；淀粉、果糖、葡萄糖與水溶性果膠、離子結(jié)合果膠及多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶活性呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，說明多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶參與了細胞壁果膠組分降解，導致無核君遷子果實的軟化和可溶性糖的升高。

無核君遷子與柿樹嫁接成活率高，是中國北方的主要砧木樹種，目前對君遷子的研究主要集中在嫁接適宜性及成活率方面，而忽略了其作為果樹的經(jīng)濟價值，本研究對其果實資源的開發(fā)利用具有參考價值。