云南保山初烤煙致香成分與生態因子的相關性研究

高晉軍，李 敏，關羅浩，王初亮，戰 磊，黃宙凱，高衛鍇，黃 磊

（廣東中煙工業有限責任公司 原料供應中心，廣東 廣州 510310）

0 引言

煙草香味是評定煙草及其制品品質的重要因素之一，煙葉中致香成分的種類和含量直接影響著煙葉及制品的香氣品質［1］。初烤煙葉中致香成分的解析為煙草后續加工奠定了基礎，煙葉中致香成分和含量受品種、部位、生態區域、栽培措施、烘烤調制技術等多種因素的影響［2］，遺傳因素影響香氣物質的性質和種類，環境因素則主要影響香氣物質的含量和組成比例［3-7］。目前，學者們針對煙葉致香成分的影響因素進行了研究，李偉等［8］研究了不同香型煙葉致香物質組成比例及其差異，結果表明，棕色化反應降解產物、新植二烯、苯丙氨酸類降解產物、類西柏烷類降解產物的組成比例在不同香型煙葉間具有顯著的差異。丁燕芳等［9］采用方差分析了河南、云南、貴州3個不同的生態類型區種植的4種烤煙，結果表明，環境因素是影響美拉德反應產物、苯丙氨酸類降解產物含量的關鍵因素，對類胡蘿卜素降解產物和新植二烯的影響主要通過與生態因素互作起作用。Yang等［10］利用云南、貴州、河南3個地區煙葉致香物質含量的差異，采用PCA分析開展了煙葉產地的溯源，結果表明，不同的生態因子（平均溫度、降雨量、光照時間、海拔高度）條件下煙葉的致香成分存在差異。Zhang等［11］采用方差分析和支持向量機算法測算了影響致香成分含量的生態因素依次為：光照時間、產地最高溫度、降雨量、產地的最低溫度、產地的平均溫度、空氣濕度。Yun等［12］采用相關性分析研究了光照強度對中性致香成分的影響，結果表明，光照強度對中性成分的影響顯著。 Liu等［13］基于煙草中56種致香成分數據并利用PCA和SIMCA模型對四川省4個地區的煙葉進行了產地溯源，結果表明，在此4個地區煙葉品種對致香成分的影響小于生態環境的。關于致香成分整體數據信息與多種生態因子的相關性分析鮮有報道。

保山位于云南西部邊陲，地處低緯高原，屬北回歸線附近、“三江并流”大區域和橫斷山脈生物多樣性區域，立體氣候明顯，是中國煙葉生產優勢區［14］。周越等［15］研究了保山高海拔地區不同烤煙品種適宜性，結果表明，海拔對不同品種煙葉的化學成分的影響較大。何曉健等［16］研究了保山龍川江流域冬春煙和夏煙主要化學成分特點，結果表明，春夏氣候的差異對煙葉主要化學成分存在一定的影響。目前，對保山地區煙葉致香成分進行分析的文獻研究較少［17-18］，為此，本研究以云南省保山地區5個區縣2020年種植的107個初烤煙葉樣品（品種涵蓋該地區主要種植的紅大、K326、云87）為研究對象，探索不同生態環境因子（平均溫度、降雨量、光照時間、海拔高度）在保山地區的分類，并指導煙葉致香成分含量的PLS-DA分析，從中篩選出保山地區受環境因子影響較大的致香成分，為保山地區煙葉的種植規劃提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從保山地區的1區4縣（隆陽、昌寧、騰沖、龍陵、施甸）采集2020年初烤煙葉樣品102份（其中隆陽21個、昌寧14個、騰沖20個、龍陵23個、施甸24個，部位：C3F），煙葉品種為云煙87、紅大和K326。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 選取農戶于采收期初烤的代表性煙葉樣品2.0 kg，并編號，再記錄采樣地點的經緯度和海拔高度，作為1個樣品。從樣品中取200.0 g煙葉粉碎，充分混勻樣品后取100.0 g煙末（過60目篩）封裝，作為分析樣本備用。

1.2.2 樣品預處理方法 準確稱取備用樣品25.0 g，每個樣本平行3份，置于恒溫恒濕箱（溫度22℃，濕度60%）平衡24 h，采用同時蒸餾萃取法，萃取劑為二氯甲烷。將盛有煙末的一端加入350 mL蒸餾水置于電熱套上加熱，另一端加入30 mL二氯甲烷置于水浴鍋中加熱，水浴鍋溫度為60 ℃，同時蒸餾萃取2 h。萃取完成后，采用旋轉蒸發儀（壓力為560 MPa，轉速為65 r/min）將萃取液濃縮至1.0 mL，裝入樣品瓶中，待測。

1.2.3 致香成分含量測定 致香成分含量的測定采用GC/MS法，使用氣質聯用分析儀（Agilent GC 6890N/MS5975I）對上述萃取濃縮液進行分析，以萘為內標物，所得圖譜經計算機譜庫（NIST05，Wiley275）檢索，按照文獻［19］的方法計算各峰的相對含量。檢測指標：醇類10項、醛類14項、酮類22項、酸類3項、酯類7項、酚類6項、雜環類7項、新植二烯等，共71項指標。

1.2.4 數據分析 氣象數據由保山市氣象局提供，海拔數據由煙葉采用GPS記錄儀記錄。氣象及海拔數據系統聚類分析、不同地區初烤煙葉致香成分的多重比較分析均采用SPSS 14.0（美國，IBM）軟件完成。氣象及海拔數據、初煙致香成分含量的正交偏最小二乘判別（OPLS-DA）分析均由SIMCA-P+14.5軟件（瑞典，UMETRICS）完成。

2 結果與討論

2.1 保山地區氣象、海拔聚類及其OPLS-DA分析

2020年4～9月間昌寧、隆陽、騰沖、龍陵、施甸5個區縣的平均溫度、降雨量、日照時數及各區縣取樣點的平均海拔高度如圖1～圖4所示。

由圖1可知，平均光照時間最長的區縣為昌寧，最短的區縣為騰沖；由圖2可知，降雨量最多的地區為龍陵，隆陽和施甸的降雨較少；由圖3可知，日照時數最長的區縣為龍陵，騰沖縣的最低；由圖4可知，取樣點平均海拔最高的區縣為施甸，所有區縣的取樣點的平均海拔均超過1600 m。

圖1 2020年4～9月5個區縣的平均氣溫

圖2 2020年4～9月5個區縣的降雨量

圖3 2020年4～9月5個區縣的日照時數

圖4 4～9月5個區縣取樣點的平均海拔

為了考察上述各因素在5個地區的差異性，2020年對5個區縣大田種植期（4～9月）的煙草增加了取樣點，即對降雨量、光照時間及平均溫度的統計分析細分為按每月的上旬、中旬及下旬進行。為考察平均溫度、降雨量、光照時間、海拔高度（該地區所有取樣點的平均海拔高度）在昌寧、隆陽、騰沖、龍陵、施甸5個區縣間差異性的大小，對采集得到的數據進行了系統聚類分析。由圖5可知：當5作為聚類閾值時，5個地區的氣象及海拔數據被聚成3類，聚類結果為：隆陽、施甸和昌寧聚為1類；騰沖為1類；龍陵為1類。

圖5 5個區縣采集數據的系統聚類分析

為進一步明晰5個區縣的氣象及海拔數據被聚成3類的影響因素，對上述地區的氣象因素及海拔數據賦值進行對應的分類標簽：隆陽、施甸和昌寧賦分類標簽為1，騰沖分類標簽為2，龍陵分類標簽為3，再進行氣象和海拔數據的OPLS-DA分析，結果如圖6所示。由圖6可知，OPLS-DA對上述5個區縣氣象和海拔數據分類效果與上述聚類分析結果相似，通過OPLS-DA各因子載荷值與地區點的距離可知，第1類（施甸、隆陽、昌寧）與另外2類的主要差異指標為海拔，4、8和9月的日照時數，以及4、6、7、8和9月的平均氣溫；第2類（騰沖）與其他2類的主要差異指標為5月和6月的日照時數；第3類（龍陵）與另外2類的主要差異指標為4～9月的降雨量和7月的日照時數。

圖6 基于OPLS-DA分析的各氣象因素與系統聚類的相關性

2.2 致香成分含量差異性分析

對保山不同產區烤煙中71種致香成分含量進行了多重比較分析，結果表明，5個產區間致香成分無明顯差異的化學成分有：吡啶、5-甲基糠醛、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，其余指標在不同產區間具有顯著性差異。在所有檢測的71項指標中，特征性致香成分新植二烯含量從高到低的區縣依次為騰沖、龍陵、昌寧、隆陽、施甸，其中施甸地區的含量顯著低于其他4個地區。昌寧地區1H-吡咯-2-甲醛、1-（1H-吡咯-2-基）-乙酮含量高于其他地區；龍陵地區3-甲基-2-丁烯醛、糠酸、苯乙醛、苯乙醇、胡薄荷酮、2,3-二氫苯并呋喃、吲哚、茄酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、β-紫羅蘭酮、丁基化羥基甲苯、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮 C、巨豆三烯酮 D、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯含量高于其他地區；施甸地區的3-甲基-1-丁醇含量低于其他地區，己醛、2,4-庚二烯醛A、2,4-庚二烯醛B、壬醛、藏花醛、香葉基丙酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、寸拜醇、亞麻酸甲酯、金合歡基丙酮B含量高于其他地區；隆陽和騰沖地區的致香成分沒有顯著高于其他地區的。研究結果表明，不同產區間致香成分存在著一定的差異，這為分析氣象因子及海拔對致香物質化學成分的影響提供了基礎條件。

2.3 致香成分含量的OPLS-DA分析及主要影響致香成分指標的篩選

通過對保山5個縣市氣象及海拔聚類分析結果分析可知，昌寧、隆陽、騰沖、龍陵、施甸被分成了3類。為探尋氣象及海拔條件對致香成分的影響，以生態環境及海拔高度的聚類分析的分類結果作為OPLS-DA模式識別的監督條件，即分別將隆陽施甸和昌寧為第1類；騰沖為第2類，龍陵為第3類。對3類對應區縣樣品的致香成分進行OPLS-DA分析，第1、第2主成分得分分布結果如圖7。由圖7可知， 3類地區致香成分的OPLS-DA分類效果較明顯，說明上述3類地區的煙葉在致香成分含量信息中存在差異。

圖7 5個地區樣品致香成分OPLS-DA分類模型分類效果圖

為進一步考察致香成分指標對分類的貢獻率，采用OPLS-DA結合變量投影重要性VIP（Variable Importance in the Projection）進行分析［20］，計算公式如下：

式中：VIPj表示第j個自變量xj的投影重要性指標；P表示自變量的個數；m為提取的有效成分個 數；Whj為 軸Wh的 第j個 分量表示成分th對因變量Y的解釋能力，r(y;th)是因變量Y和主成分th的相關系數表示m個成分t1，t2,…，tm對Y的累計解釋能力。VIP值反映的是所有自變量X（致香成分指標）對于因變量Y（分類）的解釋能力，VIP值越大，對Y的解釋能力越強，VIP值大于1的變量具有較大的相關性，對于Y的解釋具有重要貢獻。

由表1可知，VIP值大于1的指標共有24個，依次為：糠酸、β-大馬酮、茄酮、巨豆三烯酮D、丁基化羥基甲苯、苯乙醇、β-二氫大馬酮、巨豆三烯酮B、3-甲基-2-丁烯醛、2-吡啶甲醛、巨豆三烯酮C、β-紫羅蘭酮、1-(3-吡啶基)-乙酮、巨豆三烯酮A、4-甲基苯酚、苯甲醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、吲哚、2,3-二氫苯并呋喃、二氫獼猴桃內酯、3-氧代-α-紫羅蘭醇、苯乙醛、壬醛、香葉基丙酮。

表1 偏最小二乘判別分析變量投影重要性因子提取

通過OPLS-DA分析，從71種致香成分中篩選出來24個指標，包括：（1）3個β-胡蘿卜素降解產物：β-紫羅蘭酮、β-二氫大馬酮、二氫獼猴桃內酯。（2）6個葉黃素降解產物：β-大馬酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、4個巨豆三烯酮異構體（巨豆三烯酮 A、B、C、D）。（3）1個揮發性醇類：苯乙醇。（4）5個揮發性醛類：3-甲基-2-丁烯醛、2-吡啶甲醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛。（5）1個揮發性酮類：1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮。（6）2個半揮發性酮類：茄酮、香葉基丙酮。（7）2個雜環：吲哚、2,3-二氫苯并呋喃。（8）其他類化合物：糠酸、丁基化羥基甲苯、1-(3-吡啶基)-乙酮、4-甲基苯酚。

由施甸、隆陽、昌寧、騰沖和龍陵地區葉黃素降解產物總量、β-胡蘿卜素降解產物總量、巨豆三烯酮類化合物總量、糠酸含量的對比分析（表2）可知，葉黃素降解產物、β-胡蘿卜素降解產物、巨豆三烯酮類化合物總量和糠酸的含量隨著降雨量和光照時間的增加而增加。由于5個地區的平均溫度和本次取樣的平均海拔高度存在的差異較小，因此，在進一步的探索分析中需擴大采樣量，對檢測指標進行分析，并通過連續多年跟蹤研究，從機理層面分析品種、部位、等級及栽培措施等對烤煙中致香含量的影響，篩選并建立更為穩健的、受環境因子影響較大的致香成分指標。

表2 5個區縣烤煙中葉黃素降解產物、β-胡蘿卜素降解產物、巨豆三烯酮類化合物、糠酸含量的分析 μg/g

3 結論

致香成分對煙草品質具有重要的影響，為探索不同生態因子條件下種植的烤煙致香成分物質的變化，本文采用生態因子（平均溫度、降雨量、日照時長、海拔高度）的系統聚類分析結果指導致香成分的PLS-DA分析，并從中篩選出保山5個區縣受環境因子影響較大的24種致香成分。進一步分析了葉黃素降解產物、β-胡蘿卜素降解產物、巨豆三烯酮類化合物總量和糠酸的含量與降雨量和光照時間的正相關關系。