基于廣泛非靶向代謝組學解析富硒黃酒發酵過程的差異代謝產物

張標金，昌曉宇，劉清蘭，陸文英，涂田華，溫國錦，萬偉杰，嚴 寒，張祥喜

（1.江西省農業科學院 農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200；2.江西省石城縣農業農村局，江西 石城 342700）

硒（Selenium， Se）具有抗衰老、抗癌和解毒等多種生理功能［1-2］；食用富硒食品是提高人體硒攝入量的理想途徑。黃酒富含低聚糖、酚類、活性肽、維生素、礦物質、有機酸、氨基酸等營養功能成分，具有抗氧化、增強免疫力、降血壓、保護心血管、改善腸道菌群微生態環境等保健功能［3］。近年來，我國黃酒產量不斷上升，據國家統計局調查，其年產量從2009年的10.63億L增長至2020年的36.50億L。江西是我國黃酒的重要產區之一，以甜黃酒為主，著名的九江封缸酒是人們重要的日常消費飲品。開發富硒黃酒產品，發揮硒元素和黃酒的雙重營養保健功能，對增加富硒產品類型，豐富人們的補硒方式，促進黃酒產業的多元化發展等具有重要意義。本研究利用富硒糯米釀制富硒黃酒，分析了富硒黃酒的總硒和有機硒含量，并采用基于廣泛非靶向代謝組技術解析了富硒黃酒發酵過程中的代謝物差異，以期為富硒黃酒的開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 原料

菌種：采用江西本地傳統發酵菌劑。

富硒糯米和普通糯米：供試水稻品種為贛糯8號，其種子由江西省農業科學院水稻研究所提供。在江西省農業科學院高安基地將贛糯8號作中稻種植，在抽穗期葉面噴施含亞硒酸鈉的葉面肥（葉面肥硒含量為5 mg/L），每公頃噴施1500 L；在黃熟后收獲稻谷，碾制成富硒糯米。以不噴施葉面肥的常規栽培收獲的該品種稻米作為對照，制備成普通糯米。在種植前取田間土壤樣品3個，按NY/T 1104─2006《土壤中全硒的測定》中的方法檢測土壤總硒含量，檢測結果為0.35 mg/kg。

1.2 主要儀器

氫化物發生-原子熒光光譜儀、超高效液相色譜儀、高分辨質譜儀、色譜柱。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酒的制備 取富硒糯米和普通糯米各50 kg，按照浸米、蒸飯、加酒曲、落罐主發酵、后發酵、壓榨等傳統步驟釀制甜型黃酒，每個處理重復6次，取樣分析黃酒的總硒和有機硒含量，并取樣置于-80 ℃冰箱保存，用于代謝組學分析。

1.3.2 大米和黃酒總硒及有機硒含量的測定 采用GB 5009.93─2017《食品安全國家標準：食品中硒的測定》中的氫化物原子熒光光譜法測定糯米和黃酒的總硒含量；采用DB 36/T 1243─2020《稻米中有機硒和無機硒含量的測定：氫化物原子熒光光譜法》測定糯米有機硒含量；參考DBS 42010─2018《食品安全地方標準：富硒食品中無機硒的測定方法》中的固相萃取原子熒光光譜法檢測黃酒的無機硒含量；有機硒含量由總硒含量減去無機硒含量得到。使用SPSS 22.0軟件對測定數據進行統計分析。

1.3.3 代謝物的提取 稱取100 μL樣本，加入500 μL含有內標（1000∶2）的提取液（甲醇與乙腈的體積比=1∶1，內標濃度為2 mg/L），渦漩混勻30 s，超聲10 min（冰水浴），在-20 ℃下靜置1 h；將樣本在4 ℃下以12000 r/min離心15 min；然后小心地取出500 μL上清于EP管中，在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入160 μL提取液（乙腈與水的體積比為1∶1）復溶，渦漩30 s，冰水浴超聲10 min；將樣本在4 ℃下以12000 r/min離心15 min；小心地取出120 μL上清于2 mL進樣瓶，每個樣本各取10 μL，混合成QC樣本，用于上機檢測。

1.3.4 上機檢測 用于代謝組學分析的液質聯用系統由超高效液相串聯高分辨質譜儀組成。

液相條件：色譜柱為1.8 μm×2.1 mm×100 mm；流動相A為超純水溶液（加0.1%甲酸）；流動相B為乙腈溶液（加0.1%甲酸）。洗脫梯度：在開始時B相比例為2%；在0～10.00 min期間，B相比例由2%線性增加到98%；在10.00～13.00 min期間，B相比例維持在98%；在13.00～13.10 min期間，B相比例降為2%；此后B相比例以2%平衡至15 min。柱溫40 ℃；進樣量1 μL；流速0.40 mL/min。

質譜條件：采用在高分辨質譜儀采集軟件控制下的MSe模式進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，同時對低碰撞能量及高碰撞能量進行雙通道數據采集。低碰撞能量2 V，高碰撞能量區間為10～40 V，掃描頻率為每0.2 s 1張質譜圖。ESI離子源參數如下：毛細管電壓2000 V（正離子模式）或-1500 V（負離子模式）；錐孔電壓30 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；反吹氣流速50 L/h；脫溶劑氣流速800 L/h。

1.3.5 數據處理 采用ProgenesisQI軟件對Mass-LynxV 4.2采集的原始數據進行峰提取、峰對齊等處理；基于ProgenesisQI軟件的在線METLIN數據庫，以及北京百邁客生物科技有限公司的自建庫進行鑒定，同時進行理論碎片識別，質量數偏差均在100 mg/kg以內。采用R軟件對鑒定的代謝產物進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。根據OPLS-DA模型獲得的變量重要性投影（VIP）評分，將VIP＞1且P＜0.05的代謝物定義為差異代謝物，同時將得到的相應差異代謝物通過KEGG代謝通路數據庫進行解析。

2 結果與分析

2.1 理化性狀分析

用于釀制黃酒的原料富硒糯米和普通糯米的硒含量分別為198.3、35.2 μg/kg，其中富硒糯米的硒含量滿足國家標準GB/T 22499─2008《富硒稻谷》中40～300 μg/kg的要求。富硒黃酒和普通黃酒酒液中的硒含量分別為41.1、9.4 μg/L，前者是后者的4.37倍，用富硒糯米釀制的黃酒的富硒效果明顯；富硒黃酒和普通黃酒的硒轉化率［硒轉化率（%）=黃酒總硒含量/大米總硒含量×100%］分別為20.73%、26.70%（表1），說明利用富硒糯米釀制富硒黃酒是可行的。

本試驗制備的2種糯米的有機硒比例［有機硒比例（%）=有機硒含量/總硒含量×100%］都達到了83%以上，釀制的2種黃酒的有機硒比例均達到了85%以上（表1）。說明富硒糯米和富硒黃酒中的硒都以有機硒為主，在糯米發酵過程中，有機硒得到了良好的保留，并充分釋放到了黃酒酒液中，因此富硒黃酒具有較高的補硒價值。

表1 富硒黃酒和普通黃酒的理化性狀

2.2 多元統計分析

對樣品進行主成分分析（PCA），結果顯示：第一主成分（PC1）的貢獻率為74.97%，第二主成分（PC2）的貢獻率為13.05%，兩組樣本表現出明顯的分離趨勢；主成分的累計貢獻率達88.02%（圖1），因此，PCA的結果能夠從總體上反映富硒黃酒和普通黃酒之間的代謝物差異，說明所建立的PCA模型是穩定的，可用于后續代謝產物差異的分析。

圖1 富硒黃酒（T）和普通黃酒（CK）代謝物的主成分分析結果

為了更準確地顯示富硒黃酒與普通黃酒之間的代謝物差異，使用有監督的正交最小偏二乘判別分析（OPLS-DA）模型進行進一步分析。結果表明：普通黃酒組樣品主要分布在PC1的負半軸，富硒黃酒組樣品主要分布在PC1的正半軸，說明該模型能夠有效區分這兩種處理的黃酒樣品；該模型的評價參數R2Y=0.998，Q2Y=0.965，均接近于1（圖2），表明該模型穩定可靠。對OPLS-DA模型進行置換檢驗，發現右側初始OPLS-DA模型的Q2遠大于左側隨機模型的Q2（圖3），說明OPLS-DA模型不存在過擬合現象，具有良好的可靠性，可根據變量投影重要度（VIP）分析篩選差異代謝物。

圖2 富硒黃酒（T）和普通黃酒（CK）代謝物的OPLS-DA分析結果

圖3 OPLS-DA模型的置換檢驗結果

2.3 差異代謝物的鑒定與分析

利用代謝組學方法在富硒黃酒和普通黃酒中鑒定出1441種代謝物。基于OPLS-DA分析結果，以VIP＞1且P＜0.05作為差異代謝物的篩選標準，共檢測到530種差異代謝物（圖4），占所有檢測代謝物的36.8%，說明富硒對黃酒代謝物質的生成具有明顯的影響。在530種差異代謝成分中，富硒黃酒有402種成分呈上調表達，即相對含量顯著高于普通黃酒，占比達75.85%；128種成分呈下調表達，即相對含量顯著低于普通黃酒，占比為24.15%。上述結果說明，富硒黃酒中上調表達代謝物的數量遠多于下調表達代謝物的數量（圖5）。

圖4 富硒黃酒（T）和普通黃酒（CK）差異代謝物的熱圖

圖5 富硒黃酒（T）和普通黃酒（CK）差異代謝物的火山圖

根據人類代謝組數據庫（HMDB）分類，差異代謝物較多的是羧酸及其衍生物、脂肪酰、有機氧化合物、甘油磷脂，占比分別為13.58%、6.98%、5.09%、3.58%（圖6）。在明確分類的差異代謝物中，總體上有61種羧酸及其衍生物、22種脂肪酰、22種有機氧化合物在富硒黃酒中的相對含量更高，有15種脂肪酰、11種甘油磷脂、11種羧酸及其衍生物在普通黃酒中的相對含量更高。

圖6 差異代謝物的HMDB分類結果

2.4 主要差異代謝成分分析

將差異倍數（fold change， FC）作為重要的考察指標，以FC＞5或FC＜0.2，且VIP＞1、P＜0.05作為標準篩選差異倍數較大的代謝物，得到22種差異代謝物，其中富硒黃酒中有17種顯著下調，5種顯著上調。下調代謝物類別以甘油磷脂為主，共11種；上調代謝物包含2種有機氧化合物，以及甘油磷脂、蝶啶及其衍生物、脂肪酰各1種。

2.5 KEGG通路富集分析

通過KEGG數據庫對差異代謝物進行通路富集分析，在鑒定出來的530種差異顯著的代謝物中被KEGG注釋到的代謝物數為177個，其中有128個差異代謝物顯著上調，49個差異代謝物顯著下調，主要分布在84條代謝途徑中，其中富集程度居前5位的代謝通路為：花生四烯酸代謝，代謝物包括白三烯類、前列腺素類、磷脂酰膽堿類、血栓素B2、5-羥基二十碳四烯酸鹽等14種化合物；異喹啉生物堿生物合成，代謝物包含4-羥基苯乙醛、酪胺、L-酪氨酸、4-羥基肉桂酸等5種化合物；苯丙氨酸代謝，代謝物包含反式肉桂酸、苯丙酮酸、D-苯丙氨酸、2-苯乙醇、N-乙酰-D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、苯乙胺、麻黃堿等13種化合物；精氨酸生物合成，代謝物包含L-精氨酸、瓜氨酸、L-谷氨酰胺、N-乙酰鳥氨酸等8種化合物；乙醛酸和二羧酸代謝，代謝物包含檸檬酸、乙醛酸、甘油酸、L-蘋果酸等6種化合物（圖7）。

圖7 差異代謝物的KEGG富集通路分析結果

3 討論與結論

富硒大米是我國目前開發的主要富硒農產品類型，但富硒大米的深加工開發力度還遠遠不足。黃酒是大米的重要深加工方向之一，市場上還很少見富硒黃酒類產品的銷售。陸步詩等［4］采用富有機硒酵母烹調黃酒，研制了有機硒含量高達16～17 μg/mL的黃酒；李海洲等［5］利用富硒蛹蟲草和富硒大米，研制得到了硒含量為 0.10 mg/L的蛹蟲草黃酒；張翼［6］對44個黃酒產品的硒含量進行了檢測，結果發現黃酒中硒的含量范圍為0.41～16.75 μg/kg。這些研究報道說明黃酒具有作為富硒產品開發的潛力。本研究以符合國家標準GB/T 22499─2008《富硒稻谷》的富硒糯米為硒源，制備了硒含量為41.1 μg/L的富硒黃酒，其硒含量適中。目前，我國還未制定富硒黃酒的國家或行業標準。根據本研究的黃酒釀制過程的硒轉化率，結合國家富硒稻米標準硒含量0.04～0.30 mg/kg的規定，建議將富硒黃酒硒含量的標準設定為0.01～0.08 mg/L。

自然界中硒可分為無機硒和有機硒，無機硒包括Se（VI）、Se（IV）、Se（0）和Se（-II）等，大米中有機硒主要以硒代氨基酸的形態存在［7-8］。無機硒具有較大的毒性，不易被人體吸收，生物利用率低；而有機硒具有低毒高效的特點，其吸收利用效果和安全性均遠高于無機硒［9］。本研究以富硒糯米為硒源，制備富硒黃酒，富硒黃酒中的硒以有機硒為主，占比達到了85%以上，其有機硒安全易吸收，可以作為人們補硒的良好來源。

代謝組學作為一門新興的高通量鑒定技術，在小分子代謝成分的定性和定量分析方面具有獨特的優勢。目前將代謝組學應用于黃酒、葡萄酒等發酵過程的代謝產物的變化研究已有報道［10-12］。已有研究表明，硒對銀杏［13］、西蘭花［14］、雪櫻子［15］、奶牛［16］等動植物代謝產物都具有明顯的影響，但硒對酒類（特別是黃酒）發酵過程中代謝成分的影響還未見研究報道。本研究結果表明，富硒黃酒相對于普通黃酒的上調表達代謝產物數遠多于下調數，其中羧酸及其衍生物是主要的上調代謝物類型之一，其主要來源于糯米淀粉類組分的發酵分解，這暗示硒促進了根霉等發酵菌劑的代謝分解速率。筆者進一步篩選差異倍數較大的主要差異代謝物，發現下調數量明顯多于上調數量，并且以甘油磷脂為主，甘油磷脂主要是糯米磷脂類物質的代謝產物，這表明硒對磷脂類的代謝可能具有一定的抑制作用。KEGG代謝通路分析結果表明，花生四烯酸代謝、異喹啉生物堿生物合成、苯丙氨酸代謝、精氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝等是富集程度居前5位的代謝途徑，主要涉及多不飽和脂肪酸、氨基酸（以苯丙氨酸、絡氨酸、精氨酸為前體）、小分子有機酸等的代謝合成，這些成分主要涉及到黃酒風味物質的形成。綜合代謝組學的分析研究結果，富硒對黃酒發酵過程的代謝產物具有明顯的調控作用，進而可能影響富硒黃酒產品的功能成分和營養品質。