不同氮用量對(duì)烤煙品種氮代謝及烘烤特性的影響

李許濤，武廣鵬，李偉觀，周碩野，田效園

（河南省煙草公司，河南 鄭州 450018）

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的重要營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)植物的物質(zhì)代謝、生化過(guò)程以及產(chǎn)品品質(zhì)等都具有重要的影響。在煙草中，氮代謝相關(guān)酶［硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）等］的活性可以直接反映煙草對(duì)氮素同化和吸收的水平［1］。周健飛等［2］的研究表明增加施氮量可使GS活性峰值推遲，且不同品種的GS活性不同。張生杰等［3］的研究表明在不同基因型烤煙間的煙葉NR活性均達(dá)到極顯著差異，與劉衛(wèi)群等［4］的研究結(jié)果相近。不同氮效率的烤煙品種的GDH活性不同，氮高效品種的GDH活性較低，增加氮用量不利于烤煙的成熟落黃［5］。同時(shí)氮代謝也會(huì)對(duì)煙葉的次生代謝產(chǎn)生影響，類胡蘿卜素和酚類化合物是煙株的主要次生代謝產(chǎn)物，亦是煙葉的重要香氣前體物質(zhì)［6-8］。劉春梅等［9］的研究表明類胡蘿卜素含量在不同基因型、氮用量處理間存在差異。酚類化合物總量在不同的煙草中有顯著差異［10］，其調(diào)制后的降解產(chǎn)物能起到增加香氣量、改善余味的作用。

此外，氮肥施用量對(duì)烤煙煙葉的成熟采烤和煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量均有重大的影響［11-12］。多酚在煙草的調(diào)制特性、色澤、等級(jí)，以及煙氣香味等各個(gè)方面起著重要作用，是衡量煙草品質(zhì)的一個(gè)重要因素，因而在提高煙葉品質(zhì)的研究中，多酚類物質(zhì)是不容忽視的［15］。在烘烤前期煙葉的變黃必須在一定含水量的條件下進(jìn)行，黃色的固定又必須通過(guò)失水干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)［13］。多酚氧化酶的活性與烤煙品種的烘烤特性存在著極為密切的關(guān)系，且不同品種的多酚氧化酶活性與烤后雜色煙比例呈顯著正相關(guān)，在定色期多酚氧化酶的活性對(duì)煙葉的耐烤性有重要的影響［14］。目前，對(duì)云煙87、NC71氮代謝和烘烤特性的研究報(bào)道較多［16-17］，但不同氮用量對(duì)烤煙品種氮代謝及烘烤特性影響的研究報(bào)道較少。因此，筆者以南陽(yáng)煙區(qū)的云煙87、NC71為試驗(yàn)材料，研究了在不同氮用量條件下烤煙氮代謝及次生代謝的差異，揭示了烤煙部分香氣前體物質(zhì)形成與氮代謝過(guò)程的內(nèi)在聯(lián)系，并且探討了在烘烤過(guò)程中水分含量和多酚氧化酶活性的變化，以期為不同烤煙品種選擇適宜的氮用量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試烤煙品種為NC71、云煙87。取煙株中部葉（從底部向上數(shù)第12～14片）進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。各試驗(yàn)處理設(shè)置5次重復(fù)。

氮代謝特性、烘烤特性試驗(yàn)于2018～2019年在南陽(yáng)市方城縣金葉園進(jìn)行。供試地土壤類型為黃壤土，土壤pH值為7.48，有機(jī)質(zhì)含量為11.45 g/kg，堿解氮含量為55.00 mg/kg，速效磷含量為15.01 mg/kg，速效鉀含量為135.00 mg/kg。烤煙分別于2018年4月28日、2019年5月3日移栽。

氮代謝特性試驗(yàn)采取裂區(qū)設(shè)計(jì)，其中品種為主區(qū)，施氮量為副區(qū)。施氮量設(shè)置低氮N1（30 kg/hm2）、中 氮 N2（45 kg/hm2）、高 氮N3（60 kg/hm2）3 個(gè)處理；于移栽后110 d取樣。烘烤特性試驗(yàn)依據(jù)不同施氮量設(shè)置3個(gè)處理，在采收后按照常規(guī)三段式烘烤工藝進(jìn)行烘烤，在烘烤過(guò)程中的第0、24、48、60、72、96、120 h取樣。烤煙種植行距120 cm，株距55 cm；其他田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)要求。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 酶活性的測(cè)定 使用北京索萊寶科技有限公司提供的試劑盒測(cè)定硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、多酚氧化酶（PPO）的活性。

1.2.2 其他生理指標(biāo)的測(cè)定 游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測(cè)定；類胡蘿卜素含量采用96%乙醇浸提法測(cè)定；煙堿含量采用乙酸萃取法測(cè)定；總酚含量采用福林酚法測(cè)定；含水量采用《YC/T 311─2009 烤煙品種烘烤特性評(píng)價(jià)》中的方法測(cè)定。

1.2.3 外觀質(zhì)量的評(píng)價(jià) 根據(jù)《GB 2635─1992烤煙》中的標(biāo)準(zhǔn)，由河南中煙公司的專家對(duì)烤后煙葉的顏色、成熟度、身份、油分、色度、葉面組織特征、柔韌性、光澤度等外觀質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、曲線擬合和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮用量對(duì)烤煙氮代謝酶活性的影響

由表1可知：NR、GOGAT酶活性在品種間整體表現(xiàn)為云煙87＞NC71；GDH、GS酶活性表現(xiàn)為NC71＞云煙87。這說(shuō)明云煙87品種煙葉在成熟期NR、GOGAT的活性較高，GDH、GS的活性較低，而NC71則相反。

表1 在不同氮用量條件下烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性的比較

在不同施氮量處理間氮代謝關(guān)鍵酶的活性也存在著一定的差異。NR、GS、GOGAT的活性隨施氮量的增加而升高，低氮處理的NR、GS和GOGAT的活性顯著低于中氮、高氮處理。在NC71中GDH的活性隨施氮量的增加而升高，在高氮處理下有最大值；而在云煙87中GDH的活性隨施氮量的增加先增加后降低，在中氮處理下有最大值。這說(shuō)明GDH活性存在著品種與氮用量互作現(xiàn)象。

NC71在高氮處理下的NR活性與云煙87在中氮處理下的NR活性差異不顯著；NC71在高氮處理下的GOGAT活性也與云煙87在中氮處理下的GOGAT活性差異不顯著，這表明NC71的氮同化和吸收能力較云煙87弱。

2.2 不同氮用量對(duì)烤煙次生代謝的影響

由表2可以看出：游離氨基酸、煙堿和類胡蘿卜素含量在不同烤煙品種間整體表現(xiàn)為云煙87＞NC71；總酚含量在2個(gè)品種間也存在著差異，整體表現(xiàn)為NC71＞云煙105，這說(shuō)明云煙87在煙葉成熟期的游離氨基酸、類胡蘿卜素、煙堿含量高于NC71。

表2 在不同氮用量條件下烤煙氮代謝及次生代謝產(chǎn)物含量的比較

在不同施氮量處理間氮代謝及次生代謝產(chǎn)物含量也存在一定的差異，其中游離氨基酸、煙堿含量隨施氮量的增加而增加；云煙87的類胡蘿卜素含量隨施氮量的增加而增加，在高氮處理下有最大值；NC71的類胡蘿卜素含量隨施氮量的增加而先增加后降低，在中氮處理下有最大值；NC71的總酚含量隨施氮量的增加而增加，在高氮處理下有最大值；云煙87的總酚含量隨施氮量的增加而先增加后降低，在中氮處理下有最大值。這說(shuō)明類胡蘿卜素、總酚的含量存在著品種與氮用量互作現(xiàn)象。

NC71在高氮處理下的游離氨基酸含量與云煙87在中氮處理下的游離氨基酸含量差異不顯著；NC71在高氮處理下的煙堿、類胡蘿卜素含量均顯著低于云煙87在中氮處理下的，這說(shuō)明NC71的煙株需要在高氮處理下才能進(jìn)行較好的次生代謝，而云煙87的煙株在中氮處理下就可以進(jìn)行較好的次生代謝。

2.3 不同氮用量對(duì)烘烤過(guò)程中煙葉含水量的影響

由圖1a和圖1b可以看出，在烤煙烘烤過(guò)程中煙葉含水量呈“”型曲線下降，不同品種及施氮量處理煙葉含水量的變化趨勢(shì)一致，均隨著烘烤時(shí)間的增加而呈下降趨勢(shì)。云煙87在48 h（定色期）前含水量下降較平緩，在48 h后含水量下降明顯加快，且不同施氮量處理的煙葉含水量均表現(xiàn)為N1＞N3＞N2。NC71在24 h（定色期）前含水量下降較平緩，在24 h后含水量下降明顯加快，且不同施氮量處理的煙葉含水量均表現(xiàn)為N3=N2＞N1。

根據(jù)不同品種及不同施氮量處理煙葉在烘烤過(guò)程中含水量的變化曲線（圖1），利用回歸方程y=ax3+bx2+cx+d對(duì)曲線進(jìn)行擬合，其中，y為煙葉含水量（%）；x為烘烤時(shí)間（h）；a、b、c、d為待定參數(shù)（表3）。所建立的回歸方程經(jīng)F測(cè)驗(yàn)，P值均小于0.0001，達(dá)極顯著水平，即擬合方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 不同品種在烘烤過(guò)程中煙葉含水量變化的擬合特征參數(shù)

進(jìn)一步求所建方程中時(shí)間的二階導(dǎo)數(shù)，可以計(jì)算出不同品種煙葉在烘烤過(guò)程中的失水速率。由圖1c和圖1d可以看出，不同品種及不同施氮量處理煙葉的失水速率均隨烘烤時(shí)間的增加而呈上升趨勢(shì)。云煙87的煙葉失水速率在中氮處理下最大，在低氮處理下次之，在高氮處理下最小。NC71的煙葉失水速率在高氮處理下最大，在中氮處理下次之，在低氮處理下最小。這表明不同品種在不同施氮量條件下煙葉的失水速率不同。

圖1 在不同氮用量條件下烤煙含水量和失水速率的變化（2年平均值）

2.4 不同氮用量對(duì)烘烤過(guò)程中煙葉PPO活性的影響

由圖2a、圖2b可以看出：云煙87在烘烤過(guò)程中煙葉的PPO活性呈“W”型曲線變化，NC71在烘烤過(guò)程中煙葉的PPO活性呈鏡像“N”型曲線變化；這2個(gè)品種的煙葉PPO活性均在烘烤時(shí)間0～24、72 h時(shí)出現(xiàn)高點(diǎn)，在48、96～120 h時(shí)出現(xiàn)低點(diǎn)，但云煙87在96～120 h出現(xiàn)低點(diǎn)后又有所增加。云煙87的煙葉PPO活性在中氮處理下最低，在高氮處理下次之，在低氮處理下最高。NC71的煙葉PPO活性在高氮處理下最低，在中氮處理下次之，在低氮處理下最高。

利用方程y=ax5+bx4+cx3+dx2+ex+f對(duì)圖2a、圖2b中的曲線進(jìn)行擬合，其中，y為煙葉的PPO活性［U/（g·min）］；x為烘烤時(shí)間（h）；a、b、c、d、e、f為待定參數(shù)（表4）。對(duì)所建立的各個(gè)回歸方程進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)，結(jié)果P值均小于0.0001，達(dá)極顯著水平，即擬合方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 不同品種在烘烤過(guò)程中煙葉PPO活性變化的擬合特征參數(shù)

進(jìn)一步求上述擬合方程中時(shí)間的二階導(dǎo)數(shù)，可以計(jì)算出不同品種煙葉PPO的積累速率。從圖2c、圖2d可以看出，不同品種及施氮量處理煙葉PPO的積累速率均隨著烘烤時(shí)間的增加而呈上升趨勢(shì)。云煙87在中氮處理下PPO積累速率最慢，NC71在高氮處理下PPO積累速率最慢。這表明不同品種在不同施氮量條件下煙葉PPO的積累速率不同。

圖2 在不同氮用量條件下煙葉PPO活性和積累速率的變化（2年平均值）

2.5 不同氮用量對(duì)烘烤過(guò)程中煙葉總酚含量的影響

由圖3a、圖3b可以看出，不同品種及不同施氮量處理煙葉的總酚含量在烘烤過(guò)程中均呈“N”型曲線變化，在烘烤時(shí)間0～48 h期間上升，之后緩慢下降，在72 h后再次上升并達(dá)到最高值。適宜的施氮量能夠有效地提高煙葉總酚的含量，云煙87在中氮處理下煙葉總酚含量最高；NC71在高氮處理下煙葉總酚含量最高。

利用方程y=ax5+bx4+cx3+dx2+ex+f對(duì)圖3a、圖3b中的曲線進(jìn)行擬合，其中，y為煙葉的總酚含量（mg/g）；x為烘烤時(shí)間（h）；a、b、c、d、e、f為待定參數(shù)（表5）。對(duì)所建立的回歸方程進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)，結(jié)果各方程的P值均小于0.0001，達(dá)極顯著水平，即擬合方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表5 不同品種在烘烤過(guò)程中煙葉總酚含量變化的擬合特征參數(shù)

進(jìn)一步求上述方程中時(shí)間的二階導(dǎo)數(shù)，可以計(jì)算出不同品種煙葉的總酚氧化速率。由圖3c、圖3d可以看出，不同品種及不同施氮量處理煙葉的總酚氧化速率均隨著烘烤時(shí)間的增加而呈上升趨勢(shì)。在不同施氮量處理下云煙87煙葉的總酚氧化速率表現(xiàn)為N1＞N2=N3，而NC71的總酚氧化速率表現(xiàn)為N2＞N1＞N3。這表明不同品種在不同施氮量條件下煙葉的總酚氧化速率不同。

圖3 在不同氮用量條件下煙葉總酚含量和氧化速率的變化（2年平均值）

2.6 不同氮用量對(duì)烤后煙葉外觀質(zhì)量的影響

由表6可知：烤煙外觀質(zhì)量各項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)得分在不同品種間整體差異不顯著，但在不同施氮量處理間存在著一定的差異；NC71在高氮處理下烤煙外觀質(zhì)量各項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)得分與云煙87在中氮處理下的差異不顯著，且顯著高于其他處理。

表6 不同施氮量處理對(duì)烤煙外觀質(zhì)量評(píng)價(jià)得分的影響

3 討論與結(jié)論

烤煙吸收的氮素以硝態(tài)氮為主。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著施氮量的增加，硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）的活性均提高，這與岳紅賓［18］、高琴［19］等的研究結(jié)果相同，表明烤煙植株吸收、同化、再同化氮素的能力與施氮水平呈正相關(guān)。本試驗(yàn)在煙葉成熟期取樣，谷氨酸脫氫酶（GDH）表現(xiàn)為脫氨作用，這與前人［20-21］的研究結(jié)果一致。在不同烤煙品種間氮代謝的特性差異較大［22］，煙株葉片中的氮代謝產(chǎn)物含量也可以在一定程度上反映不同品種氮吸收、同化的差異。云煙87在成熟期的NR、GOGAT活性較高，GDH活性較低，表明其吸收、同化氮素的能力較強(qiáng)。NC71在成熟期的NR、GOGAT活性較弱，GDH活性較強(qiáng)，表明其吸收、再同化氮素的能力弱，氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解量較大，此研究結(jié)果與周健飛等［23］的研究結(jié)果相同。本研究還發(fā)現(xiàn)：烤煙中游離氨基酸、煙堿等氮代謝產(chǎn)物的含量亦隨著施氮水平的提高而增加［23-24］；總酚含量在不同品種間存在差異，總體表現(xiàn)為NC71＞云煙87；NC71的總酚含量隨著施氮量的增加而增加，云煙87的總酚含量則隨著施氮量的增加而先增加后減少；不同品種煙葉的類胡蘿卜素含量總體表現(xiàn)為云煙87＞NC71，進(jìn)一步說(shuō)明NC71在成熟期吸收、再同化氮素的能力弱；高氮（施氮60 kg/hm2）處理有利于烤煙氮代謝及其次生代謝物的積累，從而有助于烤煙部分香氣前體物質(zhì)的形成和煙葉落黃，進(jìn)而可以改善煙葉的香氣質(zhì)量，提高煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前，烘烤特性多以易烤性和耐烤性來(lái)評(píng)價(jià)，烤煙品種的烘烤特性與烘烤質(zhì)量及烘烤工藝密切相關(guān)，制定適于不同品種的烘烤方法是提高煙葉質(zhì)量的前提［25］。不同烤煙品種具有不同的烘烤特性［26］。在實(shí)際生產(chǎn)中，煙農(nóng)對(duì)新品種的烘烤特性認(rèn)識(shí)不夠，容易烤壞煙葉。王傳義［27］用失水性、葉綠素降低速率和多酚氧化酶活性來(lái)綜合評(píng)價(jià)品種的烘烤特性。在烘烤過(guò)程中，煙葉的失水特性和變黃特性直接反映了易烤性。煙葉在變黃和定色期間對(duì)環(huán)境溫濕度的忍耐性反映了耐烤性［28］。本研究結(jié)果表明：云煙87在中氮條件下、NC71在高氮條件下的變黃與失水較為協(xié)調(diào)，表現(xiàn)出較好的易烤性。多酚氧化酶活性高的品種，在定色期間多酚類物質(zhì)容易發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)，造成烤后雜色煙的比例較大［29］。在本試驗(yàn)中，各品種的PPO活性在定色期有明顯的高峰，這與蘭俊榮等［30］的研究結(jié)果一致。這可能是由于在烘烤過(guò)程中煙葉水分不斷流失，煙葉細(xì)胞裂解較快，導(dǎo)致細(xì)胞完整性被破壞［31］。從本研究定色期（72 h）的結(jié)果來(lái)看，云煙87在中氮條件下、NC71在高氮條件下多酚氧化酶的積累速率增加較緩慢，烤后煙品質(zhì)較好，耐烤性較好。