STC1、TWEAK、miR-183在COPD患者中的表達及相關性研究

蔣麗萍，李文珍，韋江妹

(海南醫學院第二附屬醫院腫瘤外科，海南 海口 570311)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續氣流受限和相應呼吸系統癥狀為臨床特征的呼吸疾病，主要臨床表現為咳嗽、氣促、喘息等[1]。COPD隨著病情加重可進一步發展為肺心病、呼吸衰竭，嚴重影響患者生命安全，世界衛生組織報道，隨著發達國家人口老齡化加劇和發展中國家吸煙率提升，未來40年COPD患病率會持續上升，預計到2060年COPD及相關疾病死亡病例將超過540萬[2]。盡早評估COPD嚴重程度對臨床制定個體化方案和防治病情惡化意義重大。COPD的發病機制尚未完全明確，目前研究認為是吸入有害氣體或顆粒可引起氣道炎癥反應和氧化應激及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等多種途徑參與COPD發生發展[3-4]。斯鈣素1(stanniocalcin 1，STC1)是一種糖蛋白激素，研究報道STC1能通過抑制氧化損傷和細胞凋亡保護視網膜神經節細胞[5]。腫瘤壞死因子相關弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是一種多功能細胞因子，具有調節炎癥和細胞增殖、分化、黏附等功能[6]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類基因調控分子，能影響靶基因表達調控相關信號通路參與COPD發生發展[7]。研究報道miR-183與炎癥疾病狼瘡腎炎的疾病活動程度相關[8]。探討STC1、TWEAK、miRNA-183在COPD患者中的表達及相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年12月我院收治的COPD患者114例為COPD組，其中男性68例，女性46例；年齡38～78歲，平均(62.54±5.87)歲；體重指數18～25，平均22.54±1.52；病程2～15年，平均(5.36±1.78)年。納入標準：①符合《慢性阻塞性肺疾病診治中國指南(2013年修訂版)》[9]COPD診斷標準；②年齡≥18歲；③臨床資料完整者。排除標準：①肺部手術史或合并肺間質纖維化、肺結核、哮喘、支氣管肺炎等其他肺部疾病者；②合并急慢性炎癥性疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器損害者；④惡性腫瘤患者；⑤合并免疫、血液系統疾病者；⑥近3個月接受免疫抑制劑、激素藥物治療者。另選取同期體檢健康者63例為對照組，其中男性38例，女性25例；年齡24～78歲，平均(62.11±5.72)歲；體重指數18～25，平均22.42±1.48。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫院倫理委員會批準，患者及其家屬均知情研究且簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1肺功能檢查 所有受試者入院后2 h內使用麥邦MAS-99肺功能檢測儀檢查第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，FEV1)和用力肺活量(forced vital capacity，FVC)，計算FEV1/FVC。

1.2.2血清指標測定 采集COPD組入院時和對照組體檢時靜脈血，3 000 r/min離心10 min，半徑8 cm，取上清液，-80 ℃保存待檢。部分使用Trizol試劑盒提取血清總RNA，驗證RNA濃度和純度后，Takara逆轉錄試劑盒轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR擴增。miR-183正向引物：5′-ACATCACATCGGTAGTTGCCAT-3′，反向引物：5′-AAACAAAGAGGTAAAGGTGCA-3′。反應體系：1 μL cDNA、0.3 μL引物、5 μL SYBRPremix Ex Taq II Mix、3.4 μL ddH2O；反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環40次。內參U6正向引物：5′-CCACGAGTCTCTTT-CGAGC-3′，反向引物：5′- TTGACGTTTCACGA-TACAT -3′。2-△△Ct法計算血清miR-183相對表達量。其余部分酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定血清STC1、TWEAK、白細胞介素(interleukin，IL)6、IL-8水平，硫代比色法測定血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，黃嘌呤氧化法測定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，試劑盒均由上海梵態生物科技有限公司提供，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3病情嚴重程度和預后分組 COPD患者入院吸入支氣管舒張劑后參考《慢性阻塞性肺疾病診治中國指南(2013年修訂版)》[9]根據氣流受限程度分級，極重度：FEV1<30%；重度：FEV130～49%；中度：FEV150%～79%；輕度：FEV1≥80%；根據氣流受限程度將患者分為重度組(極重度和重度)23例、中度組48例、輕度組43例。并根據《慢性阻塞性肺疾病診治中國指南(2013年修訂版)》[9]接受常規平喘、化痰、抗感染、無創通氣等治療，以患者痊愈出院或死亡的研究終點，分為病死組22例和存活組92例。

1.4統計學方法 應用SPSS 26.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗、Fisher檢驗；等級資料比較采用Z檢驗；計量資料比較采用獨立樣本t檢驗、SNK-q檢驗；相關性采用Pearson相關性分析；ROC曲線分析血清STC1、TWEAK、miR-183水平對COPD患者預后不良的預測價值，并計算曲線下面積(area under curve，AUC)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1COPD組和對照組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較 COPD組血清STC1水平低于對照組，TWEAK、miR-183水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 COPD組和對照組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較Table 1 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels between the COPD and control groups

2.2COPD組和對照組肺功能、氧化應激、炎癥指標比較 COPD組FEV1、FEV1/FVC和血清MDA、IL-6、IL-8水平高于對照組，SOD水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 COPD組和對照組肺功能、氧化應激、炎癥指標比較Table 2 Comparison of lung function, oxidative stress and inflammation indicators between the COPD and control groups

2.3不同COPD嚴重程度患者血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較 輕、中、重度組血清STC1水平依次降低，TWEAK、miR-183水平依次升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同COPD嚴重程度患者血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較Table 3 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in patients with different COPD severity

2.4不同COPD嚴重程度患者血清氧化應激、炎癥指標比較 輕、中、重度組血清MDA、IL-6、IL-8水平依次升高，SOD水平依次降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同COPD嚴重程度患者血清氧化應激、炎癥指標比較Table 4 Comparison of serum oxidative stress and inflammation indicators in patients with different COPD severity

2.5COPD組血清STC1、TWEAK、miR-183水平與肺功能、氧化應激、炎癥指標的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，COPD組血清STC1水平與FEV1、FEV1/FVC、SOD呈正相關，與MDA、IL-6、IL-8呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)，TWEAK、miR-183水平與FEV1、FEV1/FVC、SOD呈負相關，與MDA、IL-6、IL-8呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 COPD組血清STC1、TWEAK、miR-183水平與肺功能、氧化應激、炎癥指標的相關性Table 5 Correlation of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels with lung function, oxidative stress and inflammation indicators in the COPD group

2.6病死組與存活組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較 病死組血清STC1水平明顯低于存活組，TWEAK、miR-183水平明顯高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 病死組與存活組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較Table 6 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels between the death and survival groups

2.7血清STC1、TWEAK、miR-183水平對COPD患者預后不良的預測價值 ROC曲線顯示，STC1+TWEAK+miR-183預測COPD患者預后不良的AUC明顯大于各指標單獨預測(Z=2.632、2.680、3.189，P=0.009、0.007、0.001)。見表7，圖1。

表7 血清STC1、TWEAK、miR-183水平對COPD患者預后不良的預測價值Table 7 Predictive value of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in poor prognosis in COPD patients

圖1 血清STC1、TWEAK、miR-183水平預測COPD患者預后不良的ROC曲線Figure 1 ROC curves of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in predicting poor prognosis in COPD patients

3 討 論

COPD中央氣道壁存在T細胞、B細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等多種炎性細胞浸潤，增加黏液分泌物阻塞氣道管腔導致氣道阻塞，也可促進成纖維細胞和平滑肌增生導致氣道重塑[10]。同時吸入有害氣體或顆粒后，可增加肺部活性氧含量，引起體內氧化與抗氧化失衡，導致氣道和肺組織損傷，破壞肺實質，也是COPD進展機制之一[11]。本研究中COPD組血清氧化損傷標志物SOD水平和炎癥因子IL-6、IL-8水平明顯升高，抗氧化酶SOD水平明顯降低，同時輕、中、重度組血清SOD水平依次降低，MDA、IL-6、IL-8水平依次升高，符合上述報道機制。盡管目前已明確氧化應激和炎癥反應在COPD中的作用，并已開發相關抗氧化應激和炎癥反應治療方法，但COPD仍然是導致人類死亡的重要病因，因此還需探索相關生物標記物，以闡述COPD發病機制和指導臨床治療。

STC1是一種內分泌因子，在所有組織中均有表達，參與調節鈣離子和磷酸鹽穩態，既往研究多報道其在各種腫瘤中的作用，參與腫瘤細胞分化和血管生成等過程[12-13]。近年研究報道，STC1還參與細胞凋亡和氧化應激等過程。一項肺癌研究顯示，間充質基質細胞能通過分泌STC1降低肺癌細胞內活性氧水平，增加肺癌細胞存活率[14]。同時研究報道，齊墩果酸能通過STC1調節解偶聯蛋白2表達，減輕阿爾茨海默病細胞氧化應激[15]。但是否通過氧化應激參與COPD尚不明確。本研究結果顯示，COPD組血清STC1水平明顯低于對照組，輕、中、重度組血清STC1水平依次降低，并與FEV1、FEV1/FVC呈正相關，說明STC1參與COPD發生發展。進一步分析，COPD組血清STC1水平與SOD呈正相關，與MDA、IL-6、IL-8呈負相關，說明STC1與COPD病情進展中的氧化應激和炎癥反應密切相關。Tang等[16]通過脂多糖誘導小鼠急性肺損傷顯示，肺部存在明顯氧化應激和炎癥反應，注射重組STC1后肺部氧化應激和炎癥明顯改善。考慮是STC1參與抗氧化應激過程，STC1水平降低反映機體氧化應激增加，過度氧化也會刺激肺部炎癥反應，且隨著炎癥反應加重，又可加劇氧化與抗氧化失衡，因此STC1能通過氧化應激和炎癥反應途徑參與COPD進展，相關機制還需進一步證實。

TWEAK是TNF家族一個新成員，在炎癥、氧化應激、機械、組織損傷過程中可大量分泌，并結合細胞表面受體Fn14激活核因子κB信號通路，參與炎癥反應[6]。近年多項研究也報道TWEAK與急性ST段抬高型心肌梗死、心腎綜合征等炎癥疾病密切相關[17-18]。而同樣作為一種炎癥疾病，關于TWEAK與COPD病情進展的關系卻無研究報道，本研究結果顯示，COPD組血清TWEAK水平明顯高于對照組，輕、中、重度組血清TWEAK水平依次升高低，并與FEV1、FEV1/FVC呈負相關，說明TWEAK參與COPD發生發展，分析與COPD患者炎癥反應、氧化應激下刺激TWEAK大量分泌有關。本研究結果也顯示，COPD組血清TWEAK水平與SOD呈負相關，與MDA、IL-6、IL-8呈正相關，進一步說明TWEAK與COPD病情進展中的氧化應激和炎癥反應密切相關。Fn14是目前唯一確認的TWEAK受體，一旦Fn14表達上調，TWEAK就能結合Fn14胞外配體，激活下游信號轉導通路[6]。體外實驗顯示，敲除Fn14能減少肺微血管胞間黏附分子1和單核細胞趨化蛋白1表達，減少巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，修復膿毒癥引起的急性肺損傷[19]。本研究驗證了該研究結果，但關于TWEAK在COPD發生發展中的作用尚缺乏證據。

miRNA是內源性非編碼長約22個核苷酸的小分子RNA，持續慢性炎癥和氧化應激能引起某些miRNA異常表達，參與COPD的發生[7]。如miR-195-5p可靶向唾液酸結合Ig樣凝集素1抑制COPD的炎癥反應[20]。miR-183定位于人染色體7q32.2，為視網膜高度表達特異性miRNA，既往研究多報道其在眼科疾病中的作用，近年研究顯示，多種炎癥疾病中也能出現miR-183異常表達。如狼瘡腎炎患兒血清miR-183呈低表達[8]。同時上調miR-183能抑制缺血性卒中核因子κB活化，減輕炎癥[21]。曾宗鼎等[22]通過qRT-PCR檢測COPD患者外周血miRNAs，結果顯示，外周血miR-183表達顯著上調。本研究結果顯示，COPD組血清miR-183水平明顯高于對照組，輕、中、重度組血清miR-183水平依次升高，并與FEV1、FEV1/FVC呈負相關，說明miR-183參與COPD發生發展。同時COPD組血清miR-183水平與SOD呈負相關，與MDA、IL-6、IL-8呈正相關，說明miR-183與COPD病情進展中的氧化應激和炎癥反應密切相關，這與林烈桔等[8]研究報道的miR-183在狼瘡腎炎患兒血清表達降低不符，推測與miR-183在不同組織和疾病中的表達不同有關，還需進一步研究。本研究結果還顯示，病死組血清STC1水平明顯降低，TWEAK、miR-183水平明顯升高，提示STC1、TWEAK、miR-183還可能與COPD患者預后不良有關，ROC曲線也證實，三者均對COPD患者預后不良具有一定預測價值，同時通過聯合3個指標能顯著增加AUC，說明聯合預測能提升COPD患者預后不良預測價值。

綜上所述，COPD患者血清STC1水平降低，TWEAK、miR-183水平升高，可能通過氧化應激和炎癥反應參與COPD病情進展，可作為患者預后不良預測指標。但關于三者與COPD的具體關系還需進一步證實。