雙氫青蒿素對(duì)TGF-β1刺激的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中uPA和PAI-1含量的影響

宋玉杰，單鐵英，馬景紅，李 玲，李 偉，商小涓，栗志英

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 婦科，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學(xué)，a 醫(yī)學(xué)院，b 附屬醫(yī)院，c 國(guó)際交流學(xué)院，河北 邯鄲 056002)

近年來(lái)，因?qū)m腔黏連導(dǎo)致女性不孕的患者日漸增多[1]，雖然日益先進(jìn)的輔助生殖技術(shù)解決了許多不孕的難題，但是對(duì)于嚴(yán)重的宮腔黏連仍然沒(méi)有很好的治療方案。目前，關(guān)于宮腔黏連的病因和發(fā)病機(jī)制尚沒(méi)有統(tǒng)一的觀點(diǎn)，宮腔黏連的病理學(xué)改變特點(diǎn)為子宮內(nèi)膜組織發(fā)生纖維化改變。許多文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)參與了心臟、肝臟、肺臟以及腎臟等多種器官的組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展[2-5]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，經(jīng)TGF-β1作用的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(EECs)分裂能力增強(qiáng)，并具有肌成纖維細(xì)胞分子標(biāo)志和生物學(xué)活性[6]，但是采用中藥雙氫青蒿素(DHA)干預(yù)后，EECs的增殖、細(xì)胞分子標(biāo)志和生物學(xué)活性會(huì)出現(xiàn)何種變化尚不清楚。以前期實(shí)驗(yàn)結(jié)論為基礎(chǔ)，本研究進(jìn)一步分析DHA 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的EECs的分裂能力以及細(xì)胞中尿型纖溶酶原激活劑(uPA)和纖溶酶原激活劑抑制因子-l(PAI-1)含量的變化，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑選取2020年2月1日—2020年6月20日在邯鄲市中心醫(yī)院婦科宮腔鏡室獲取因經(jīng)期不規(guī)則做刮宮的婦女，年齡35-45 歲，刮宮日期前一年內(nèi)無(wú)激素類用藥史。組織切片顯示：正常，且處于增生期。摘取的內(nèi)膜組織必須盡快投進(jìn)冰冷的培養(yǎng)液中，盡快運(yùn)送到無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)里。整個(gè)過(guò)程屬于無(wú)菌操作。

DHA 購(gòu)買自浙江新和成股份有限公司，TGF-β1 購(gòu)自上海雙贏生物科技有限公司，角蛋白抗體、uPA和纖PAI-1抗體均購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；檢測(cè)細(xì)胞分泌活性的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1獲取內(nèi)膜組織中的EECs 沖洗干凈獲取的子宮內(nèi)膜組織碎塊，向其中加入膠原酶溶液，沒(méi)過(guò)組織碎塊，在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用35 min，經(jīng)80目的濾網(wǎng)篩出的含有子宮內(nèi)膜細(xì)胞的液體置于6 cm半徑的離心機(jī)中，調(diào)到轉(zhuǎn)速為600 r/min持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)經(jīng)孵育液12 min，離心所得的沉積物，經(jīng)培養(yǎng)液懸浮后即為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，放入含有適量濃度的血清孵育液中常規(guī)培養(yǎng)，取少許細(xì)胞用于類型鑒定和形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。

1.2.2細(xì)胞分組 按照培養(yǎng)液中加入干預(yù)試劑不同，細(xì)胞分為4組，對(duì)照組：按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)；TGF-β1 組：在常規(guī)培養(yǎng)液中加入TGF-β1；DHA組：在常規(guī)培養(yǎng)液中加入DHA；TGF-β1+DHA 組：在TGF-β1 組的基礎(chǔ)上加入DHA。TGF-β1在培養(yǎng)液中的最終含量為10 ng/mL，DHA在培養(yǎng)液中的最終含量為100 ng/mL。4組細(xì)胞同時(shí)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育時(shí)間均為48 h。

1.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將每mL培養(yǎng)液里包含細(xì)胞數(shù)量為4×104個(gè)的上述4組EECs，以200 μl的量滴入有96個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照上述1.2.2分組，每1組含有6個(gè)復(fù)制孔。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，置于無(wú)菌超凈臺(tái)中向每孔中加入噻唑藍(lán)溶液，再次放回培養(yǎng)箱作用4 h。吸出各個(gè)孔的溶液只留下孔底細(xì)胞，再向其孔內(nèi)滴入二甲基亞砜，噻唑藍(lán)和二甲基亞砜的加入量遵循細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的使用說(shuō)明書(shū)。輕輕搖動(dòng)96孔板10 min，置于適當(dāng)波長(zhǎng)的檢測(cè)儀中記錄每孔的吸光度值。

1.2.4ELISA 測(cè)定細(xì)胞的分泌活性 4組細(xì)胞的孵育液中含有細(xì)胞分泌的物質(zhì)，認(rèn)真按照說(shuō)明書(shū)中的步驟進(jìn)行依次操作，測(cè)出4 組細(xì)胞孵育液中的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量。

1.2.5檢測(cè)細(xì)胞中uPA和PAI-1的蛋白含量 通過(guò)蛋白印跡的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體如下：獲取各組細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，吸取純度合格的30 μg蛋白加入特定濃度的緩沖液，熱變性后，滴入固體膠的一端進(jìn)行電泳，獲取膠中含有目標(biāo)蛋白的條段，在轉(zhuǎn)膜儀中，將膠中的目標(biāo)蛋白移到膜中，膜經(jīng)過(guò)封閉后，先后與適量濃度的第一抗體(uPA和PAI-1)、第二抗體溶液反應(yīng)。放入暗室中加發(fā)光液后，顯影并定影于X光片中，通過(guò)專門的軟件分析X光片中的目標(biāo)蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞類型鑒定和形態(tài)觀察剛分離的EECs常呈現(xiàn)葡萄串狀、團(tuán)狀聚集在一起，培養(yǎng)5天后，細(xì)胞緊貼瓶底部呈鋪展性生長(zhǎng)，體積較大，卵圓形，先后經(jīng)堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅染色后清晰分辨出細(xì)胞中央藍(lán)色的卵圓形細(xì)胞核，核周圍的紅色細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞被角蛋白免疫染色呈現(xiàn)陽(yáng)性(圖略)。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析DHA組與對(duì)照組的吸光度值相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TGF-β1組的吸光度值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)； TGF-β1+DHA組的吸光度值明顯低于TGF-β1組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，DHA組中Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量無(wú)明顯差異(P>0.05)，TGF-β1組孵育液中兩種細(xì)胞分泌物的含量均顯著上升(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+DHA組孵育液中兩種細(xì)胞分泌物的含量明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞增殖和分泌活性的分析

a與TGF-β1組相比,P<0.05；b與對(duì)照組相比,P<0.05；c與對(duì)照組相比,P>0.05。

2.3 細(xì)胞中uPA和PAI-1蛋白含量分析與對(duì)照組相比，DHA組細(xì)胞中uPA和PAI-1蛋白的含量無(wú)明顯差異(P>0.05)，TGF-β1組細(xì)胞中uPA含量減少，而PAI-1含量增加(均P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+DHA組細(xì)胞中uPA含量增加，而PAI-1含量減少(均P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 蛋白印跡觀察4組細(xì)胞中uPA和PAI-1蛋白的灰度

表2 細(xì)胞中uPA和PAI-1蛋白的灰度值分析

3 討論

正常婦女在生理狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜組織會(huì)隨著月經(jīng)周期的變化其厚度也發(fā)生周期性的變化，即剝脫出血、增生修復(fù)[7]。確保其發(fā)生周期性變化是雌激素、孕激素含量的多少和子宮內(nèi)膜組織的基底層的增生修復(fù)功能[8]。已有文獻(xiàn)表明，宮腔黏連的發(fā)生源于許多有害因素造成子宮內(nèi)膜的深部基底層組織損傷。因此，內(nèi)膜組織不能進(jìn)行正常的修復(fù)過(guò)程，而是出現(xiàn)了異常增多的結(jié)締組織，其中含有因分解能力降低而大量堆積的細(xì)胞之間的基質(zhì)成分，也就是內(nèi)膜組織發(fā)生纖維化改變[9-10]。

TGF-β是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的超家族。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它包含有3個(gè)成員，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β為導(dǎo)致機(jī)體多種器官組織發(fā)生纖維化改變的起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，其中TGF-β1為生物學(xué)活性最強(qiáng)的成員。如果組織中TGF-β1含量異常增高，那么其發(fā)生纖維化的進(jìn)程就會(huì)越快。文獻(xiàn)研究顯示，它不但會(huì)刺激間質(zhì)細(xì)胞分裂增殖并向細(xì)胞外大量釋放基質(zhì)成分[11]。而且會(huì)刺激上皮細(xì)胞的表型和生物學(xué)活性向間質(zhì)細(xì)胞的方向發(fā)生改變[12]。來(lái)源于腎小管管壁中的上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，加入TGF-β1后，細(xì)胞的形態(tài)、分子標(biāo)志以及活性均向間質(zhì)細(xì)胞的趨向轉(zhuǎn)變[13]。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明經(jīng)TGF-β1作用的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(EECs)分裂能力增強(qiáng)，并具有肌成纖維細(xì)胞分子標(biāo)志和生物學(xué)活性[6]。這次的研究數(shù)據(jù)也表明了EECs在TGF-β1的作用下數(shù)量增加，并向孵育液中釋放大量的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白。這與上述的研究結(jié)果相一致。

機(jī)體器官組織中細(xì)胞外基質(zhì)的正常生理代謝過(guò)程比較復(fù)雜，需要多種蛋白酶類對(duì)其進(jìn)行降解，還需相應(yīng)的抑制劑拮抗其過(guò)分的降解，這樣才能保持其在組織中的正常含量。其中包括在基質(zhì)成分代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白酶激活劑和其對(duì)應(yīng)的抑制劑：uPA和PAI-1，PAI-1是uPA特異的抑制劑[14-15]。uPA作為分解基質(zhì)成分的蛋白酶激活劑，具體的作用機(jī)制如下：①作用于纖溶酶原使其具有生物學(xué)活性，分解基質(zhì)成分中的多種蛋白質(zhì)；②作用于纖溶酶，使其具有分解基質(zhì)成分中的多種蛋白質(zhì)外，還具有分解上皮組織與結(jié)締組織之間的基底膜；③作用于基質(zhì)金屬蛋白酶原使其具有生物學(xué)活性，分解基質(zhì)蛋白質(zhì)成分[16-17]。PAI-1對(duì)uPA的生物學(xué)活性具有特異性的抑制作用，二者的分子結(jié)合后，能拮抗uPA上述分解基質(zhì)成分的功能[18-19]。

腎臟組織發(fā)生病變的患者，損傷組織里的uPA含量減少，PAI-1含量增加，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞之間的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白等基質(zhì)成分增多，腎臟組織發(fā)生纖維化改變[20]。在小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示，肝臟組織中的uPA 及其受體含量增高時(shí)，細(xì)胞之間的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白等基質(zhì)成分的分解能力顯著增強(qiáng)；但如果小鼠被敲除uPA 基因后，肝臟組織會(huì)很快出現(xiàn)程度較重的纖維化改變[21]。本研究在TGF-β1刺激發(fā)生纖維化的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的數(shù)量增加，孵育液中Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量增加，細(xì)胞中uPA含量減少，而PAI-1含量增加(均P<0.05)。由此可以說(shuō)明uPA具有正向調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞纖維化改變的過(guò)程，而PAI-1具有拮抗uPA的作用。

DHA是青蒿素的一種衍生物，是中草藥青蒿素中獲得并經(jīng)過(guò)加工而成的一種生物活性物質(zhì)[22]。文獻(xiàn)報(bào)道DHA的藥理學(xué)作用較為廣泛，它具有改變免疫系統(tǒng)的活性、消滅腫瘤細(xì)胞以及降低炎癥反應(yīng)等作用[23-25]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，雙氫青蒿素能作用于肺臟間質(zhì)組織中的成纖維細(xì)胞，抑制其增殖能力和生物學(xué)活性，也就是說(shuō)使成纖維細(xì)胞合成和向細(xì)胞外釋放的基質(zhì)含量減少，從而改善肺臟組織的纖維化損傷[26]。肝組織發(fā)生纖維化病變的大鼠服用雙氫青蒿素一段時(shí)間后，病理切片發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟組織中的纖維化的病變得到減輕，免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)，肝組織中的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白等基質(zhì)蛋白成分的含量減少，評(píng)估肝功能的臨床指標(biāo)也得到相應(yīng)的恢復(fù)[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙氫青蒿素能拮抗TGF-β1作用的EECs數(shù)量增加，細(xì)胞中uPA含量減少和PAI-1含量增加。最終達(dá)到釋放Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量下降。這提示雙氫青蒿素能有效阻止TGF-β1導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜纖維化改變即防止宮腔黏連。