外泌體microRNA-212/132與創傷性顱腦損傷嚴重程度及Rotterdam CT評分的相關性研究

楊 明，劉 瑛，余 華，陽 榮

(1.潛江市中心醫院 放射科，湖北 潛江 433100；2.潛江市中心醫院 神經外科，湖北 潛江 433100；3.恩施州中心醫院 重癥醫學科，湖北 恩施 445000)

創傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是致死、致殘最常見的原因，尤以青壯年為主。伴隨城市化快速進展，交通事故逐年增加，TBI 的發病率持續增長[1]。顱腦CT檢查是臨床評估TBI患者嚴重程度的常用手段，Rotterdam CT評分對TBI患者預后有一定預測價值[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是由20-25個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，在轉錄后水平調節基因表達，參與包括發育、衰老、凋亡及代謝等生理病理過程[3]。外泌體是由多種細胞分泌的直徑為30-150 nm的脂質雙分子層囊泡，其內攜載蛋白質、mRNA和miRNA等物質，并在生理和病理條件下參與細胞間通訊[4]。TBI后局部腦組織經歷缺血缺氧、炎癥、氧化應激、細胞凋亡等多種病理變化過程，而外泌體中各種RNA特別是miRNA在調節炎癥、抗凋亡、促進神經細胞再生、維持血腦屏障穩定性等方面有關鍵性的作用[5]。有研究表明TBI病人血漿外泌體miR-212/132水平明顯下降，且與突觸可塑性、記憶形成和神經突生長均有關，是一種可靠的生物學指標[6]。但關于外泌體miRNA-212/132表達水平與TBI腦損傷嚴重程度及Rotterdam CT評分的關系還少見報道。本研究通過檢測TBI患者外泌體miR-212、miR-132表達水平變化，探討其與患者腦損傷嚴重程度及Rotterdam CT評分的相關性，以期為TBI的臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2021年1月潛江市中心醫院收治的TBI患者76例，其中，男性43例，女性33例，年齡18-79歲，平均(48.7±14.3)歲；交通事故36例、墜落傷18例，摔傷9例，砸傷13例；根據格拉斯哥昏迷評分(Glasgow coma scale，GCS)分為輕度組(13-15分)19例，中度組 (9-12分)35例，重度組(3-8分)22例。納入標準：(1)經顱腦CT檢查證實為顱腦外傷；(2)年齡≥18歲；(3)腦外傷后4 h內入院。排除標準：(1)合并顱內腫瘤、腦血管疾病、顱內感染等顱內疾病者；(2)凝血功能障礙、血液系統疾病者；(3)合并嚴重肝腎功能障礙或衰竭者；(4)神經系統進行性疾病史者。另選擇38例體檢健康者作為對照組，男性21例，女性17例，年齡18-78歲，平均(49.80±15.91)歲。本次研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1CT檢查

入院后常規行顱腦CT檢查，采用美國GE Revolution 128排CT機。初始CT圖像通過醫學圖像歸檔和通訊系統(picture archiving and communication system，PACS)進行復閱，并由2位專家獨立完成Rotterdam CT評分[7]，Rotterdam CT評分系統包括：基底池受壓程度(basal cistern compression，B-RCTS)、中線偏移度(midline shift，M-RCTS)、硬膜外血腫(epidural hematomas，E-RCTS)、腦室內或蛛網膜下腔出血(hemorrhage，H-RCTS)。

1.2.2血漿外泌體提取及鑒定

收集全血樣本，并在抽取后2 h內以3 000 r/min的速度離心10 min(4℃)，-80℃保存。將血漿樣本解凍，以3 000 r/min的轉速離心5 min，去除循環細胞或碎片。取上清液50 μl，加入外泌體提取試劑10 μl，樣品混合后孵育30 min(4℃)，然后離心10 min(1 000 g，室溫)。棄去上清液后使用緩沖液對剩余樣品進行洗脫，提取血漿外泌體，使用電鏡觀察外泌體提取情況。Western blot電泳鑒定外泌體表面特異性抗原表達[8]。

1.2.3血漿外泌體miR-212、miR-132檢測

取200 μl血漿外泌體樣本，用TRIzol試劑提取總RNA，PrimeScript First-Strand cDNA合成試劑盒(日本Takara公司)配制15 μl逆轉錄反應體系，得到cDNA模板。取2.0 μl cDNA模板和cDNAs PrimeScript RT Master Mix試劑盒(日本Takara公司)配制20 μl反應體系，在ABI PRISM 7000型熱循環儀上進行PCR反應。PCR擴增體系：95℃ 15 min、94℃15 s、55℃30 s、70℃1 min，40個循環。使用的引物為miR-212正向引物5’-GGCACCTTGGCTCTAGACTG-3’；反向引物5’-GTCGGTGGCCGTGACTG-3’。miR-132正向引物：5’-CGACCATGGCTGTAGACTGT-3’，反向引物：5’-GTCTCCAGGGCAACCGTG-3’。U6和18S rRNA作為內源性對照，用比較CT法計算相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 血漿外泌體鑒定

從血漿樣本中分離得到外泌體，通過電鏡觀察其形狀和大小以及Western blot法測定CD9、CD63和CD81膜蛋白表達。電鏡觀察外泌體呈圓形、橢圓形，具有明顯的雙層脂質包膜結構，直徑約50-120 nm。Western blot法檢測發現外泌體的特征性生物標志物CD9、CD63和CD81膜蛋白表達陽性。見圖1。

圖1 血漿外泌體鑒定(A：電鏡觀察；B：Western blot法檢測外泌體特征性膜蛋白)

2.2 兩組血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平比較

TBI組血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平均明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平比較

2.3 血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平與TBI患者嚴重程度的關系

重度組血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平明顯低于輕、中度組，中度組血漿外泌體miR-132表達水平明顯低于輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)。Spearman相關性分析顯示：血漿外泌體miR-212(r=0.396，P<0.001)、miR-132(r=0.716，P<0.001)表達水平與TBI患者腦損傷嚴重程度均呈正相關。見表2。

表2 不同嚴重程度TBI患者血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平比較(M50[P25,P75])

2.4 血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平與TBI患者Rotterdam CT評分的關系

Spearman相關性分析顯示：血漿外泌體miR-212(r=-0.375，P<0.001)、miR-132(r=-0.613，P<0.001)表達水平與TBI患者Rotterdam CT評分均呈負相關。

3 討論

TBI具有較高的發病率和病死率，是青壯年最常見的死亡和殘疾原因。TBI后首先引起腦實質受損、腦出血和軸突剪切，誘發炎癥、氧化應激、代謝紊亂和中樞神經細胞死亡，最終造成神經損傷、局部血液供應障礙、血腦屏障損傷以及周圍腦腫脹[9]。神經炎性反應在TBI的病理過程中起重要作用，抑制過度的炎性反應對于改善TBI預后至關重要[10]。小膠質細胞是炎癥和免疫反應的常駐免疫細胞，是調節神經炎性反應的重要靶點，有研究表明：TBI后靜息狀態的小膠質細胞迅速激活并釋放多種活性物質，包括外泌體，參與中樞炎性反應[11]。外泌體具有較低的免疫原性，能夠穿越血腦屏障，保護血腦屏障的完整性[12-13]。外泌體還能上調與神經再生、神經可塑性、突觸再生相關的基因，下調與神經炎癥和反應性膠質細胞增生有關的基因，發揮神經保護作用[14]。有研究表明外泌體中含有大量miRNA，調控外泌體miRNA的表達可逆轉TBI導致的神經損傷[15]。相關動物實驗研究發現，外泌體miR-212/132在大腦中呈普遍高表達，其PDCD4、Ptgs2等靶基因可通過影響內皮祖細胞的再生、血腦屏障、樹突形態以及膠質細胞的分化過程參與神經系統疾病的發生發展[16]。miR-212、miR-132都位于人類17號染色體上，其序列具有一定的同源性，可以共同調控下游靶基因。有研究證實miR-212/132可抑制緊密連接蛋白，改變低氧條件下血腦屏障的通透性[17]。有研究發現，神經元分泌含miR-132的外泌體對維持腦血管的完整性及穩定性具有重要作用[18]。本研究結果顯示，TBI患者血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平明顯低于健康對照組；并且重度TBI患者血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平明顯低于輕、中度患者，中度TBI患者血漿外泌體miR-132表達水平明顯低于輕度患者。提示外泌體miR-212、miR-132在TBI患者中呈低表達，并且隨著腦損傷程度加重其表達水平隨之降低。

顱腦CT是TBI常見的臨床診斷手段，Rotterdam CT評分是臨床應用比較廣泛的評分系統，包含對中線移位、中腦基底池受壓、顱內出血的位置等多個影像學特征的評估，這些指標與顱內壓升高密切相關。基底池的受壓程度是預測TBI患者預后的重要因素，初次CT檢查時腦池缺失或不可見的患者，其預后不良風險增加近4倍[19]。顯著的中線移位是TBI外科手術治療的關鍵指征，中線移位還與許多神經后遺癥的發生有關，是臨床上評估TBI嚴重程度的重要參數[20]。對于中線移位大于5 mm的患者，其再次手術的風險將增大[21]。Rotterdam CT評分還包含對腦出血情況的評估，有研究表明Rotterdam CT評分與TBI患者預后不良相關，Rotterdam CT評分高提示其預后不良[22]。本研究結果顯示，血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平與TBI患者Rotterdam CT評分均呈負相關。提示外泌體miR-212、miR-132表達水平能在一定程度上反映TBI患者顱腦影像學改變。另外，有研究表明術前GCS評分與TBI患者預后顯著相關[23]。本研究結果顯示，血漿外泌體miR-212、miR-132表達水平與TBI患者腦損傷嚴重程度(GCS評分)均呈正相關。提示外泌體miR-212、miR-132表達水平對TBI患者的短期預后也具有一定預測價值。因此，外泌體miR-212、miR-132可能成為防治TBI的潛在靶點以及評估TBI嚴重程度的生物標記物。

綜上所述，血漿外泌體miR-132、miR-212在TBI中表達下降，且與腦損傷嚴重程度及Rotterdam CT評分均相關，可作為評估TBI的潛在生物學指標。由于本研究樣本量較少，還需進一步擴大樣本量或多中心研究加以驗證。