固定化短乳桿菌催化合成γ-氨基丁酸的研究

孫麗慧，賀雷雨，陳業文，宮宇晴

（1.大連理工大學 海洋科學與技術學院，遼寧 盤錦 124221；2.大連理工大學 生命科學與藥學學院，遼寧 盤錦 124221）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸[1]，是一種廣泛分布于動物、植物、微生物體內的非蛋白質氨基酸[2]。它作為重要的抑制神經信息傳遞的物質[3]，能夠參與人體內多種代謝過程，具有較高的生理活性[4]，如降血壓[5]、抗氧化[6]、調節免疫力[7]等。

GABA的合成方法主要包括化學合成法、植物富集法和微生物合成法[8]。近年來微生物法生產GABA已成為國內外的研究熱點。其原理是利用某些微生物細胞中天然含有的谷氨酸脫羧酶為催化劑，將底物L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉催化為GABA[9]。目前為止已在多種常見微生物體內發現谷氨酸脫羧酶的存在[10]，相對于化學合成法和植物富集法，微生物合成法具有污染小、成本低、轉化率高、反應條件溫和等優點[11-12]，具有良好的工業化應用前景。特別是利用細胞催化將L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉轉化生成GABA，具有反應體系成分較簡單、反應時間短、分離純化操作簡單以及對環境污染小等優勢[13-14]。本課題組前期從榨菜中篩選出一株具有較強催化合成GABA能力的短乳桿菌DLF-19076，但游離細胞催化通常只能使用一次，存在轉化液容易乳化、下游分離較困難等問題[15]，而固定化細胞具有易回收、可重復使用等優點[16]。因此本文以實驗室前期篩選保藏的短乳桿菌DLF-19076細胞為研究對象，利用海藻酸鈉為載體對固定化條件、固定化細胞的酶學性質及操作穩定性進行研究，以期為生物合成GABA奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短乳桿菌DLF-19076：由大連理工大學海洋科學與技術學院食品生物技術實驗室篩選并保藏[17]；γ-氨基丁酸、5-磷酸吡哆醛（pyridoxal-5'-phosphate，PLP）（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；海藻酸鈉、L-谷氨酸鈉（均為分析純）：中國醫藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）：默克股份有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）：上海博升生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

MRS培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、檸檬酸二銨 2 g/L、K2HPO42.0 g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、吐溫-80 1mL/L，使用 1 mol/L HCl調節pH值至6.2～6.4，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

TGL-20M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；ZWY-1102C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養

將實驗室保存的菌體活化后接入MRS培養基（100 mL/250 mL）中，35℃培養24 h，培養液離心10 min后（4℃、10 000 r/min），將收集的菌體用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌3次，4℃冷藏備用。

1.3.2 海藻酸鈉包埋法固定化短乳桿菌細胞

1.3.2.1 海藻酸鈉濃度對固定化效果的影響

將5.0 mL細胞懸液分別與15.0 mL濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的海藻酸鈉溶液混合，用12號針頭注射器將混合液以60滴/min的速度滴入150 mL濃度為3.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下硬化4 h，考察海藻酸鈉濃度對固定化效果的影響。

1.3.2.2 CaCl2濃度對固定化效果的影響

將5.0 mL細胞懸液與15.0 mL濃度為3.0%的海藻酸鈉溶液混合，用12號針頭注射器將混合液以60滴/min的速度分別滴入150 mL濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下硬化4 h，考察CaCl2濃度對固定化效果的影響。

1.3.2.3 固定化細胞平均粒徑對固定化效果的影響

將5.0 mL細胞懸液與15.0 mL濃度為3.0%的海藻酸鈉溶液混合，分別采用3、5、12、16號針頭將混合液滴入到150 mL濃度為3.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下硬化4 h，制備出平均粒徑為1.3、2.2、3.2、4.8 mm的固定化小球，考察小球粒徑對固定化效果的影響。

1.3.2.4 硬化時間對固定化效果的影響

將5.0 mL細胞懸液與15.0 mL濃度為3.0%的海藻酸鈉溶液混合，采用12號針頭將混合液滴入到150 mL濃度為3.0%的氯化鈣溶液中，4℃條件下分別硬化2、4、6 h和8 h，考察硬化時間對固定化效果的影響。

1.3.2.5 固定化細胞條件的優化

在單因素試驗基礎上進行正交試驗，進一步優化細胞固定化條件。正交試驗因素水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.3.3 谷氨酸脫酸酶活力的測定

酶活力單位：在35℃、pH4.5條件下，1 min內催化L-谷氨酸鈉產生1 μmol GABA所需要的谷氨酸脫酸酶量為1個酶活力單位（U）。

酶活力測定：反應體系為0.2 mol/L的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液（pH4.5），含有 0.15 mmol/L PLP 和30 g/L L-谷氨酸鈉，加入適量菌體細胞或固定化小球，35℃水浴中反應5 min，10 000 r/min離心2 min分離細胞，采用高效液相色譜法測定GABA的含量[18]。

相對酶活力（%）：以同組最高酶活力為參照，定義其相對酶活力為100%，酶活力與同組最高酶活力的比值即為相對酶活力，以百分數形式表示。

比酶活力（U/g）：35℃、pH4.5條件下1.0 g濕菌體所具有的酶活力單位數。

1.3.4 固定化細胞機械穩定性的測定

隨機選取100粒固定化小球，放入100mL含20mL檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（0.2 mol/L、pH4.5）錐形瓶中，加入50粒直徑6 mm的玻璃珠，35℃、200 r/min下振蕩6 h。完好的小球的數量占原小球總數的比率即為機械穩定度。

1.4 數據處理

所有試驗至少重復3次，試驗結果以平均值±標準方差的形式表示，并運用方差分析進行差異性分析。

2 結果與討論

2.1 細胞固定化條件的優化

2.1.1 海藻酸鈉濃度對固定化效果的影響

海藻酸鈉濃度對固定化效果的影響見圖1。

圖1 海藻酸鈉濃度對固定化效果的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the immobilization

海藻酸鈉濃度對固定化細胞的相對酶活力和機械穩定度均有較大的影響。海藻酸鈉濃度過低，制備出的固定化小球質地綿軟，機械穩定度差。同時，由于球壁網狀結構的稀疏，攪拌硬化過程易導致菌體泄露，菌體利用率下降。海藻酸鈉濃度過高，制備出的小球結構致密，傳質效果不佳，造成底物缺乏和產物抑制[19]。由圖1可知，隨著海藻酸鈉濃度的升高，固定化細胞的相對酶活力先升高后降低，機械穩定度則逐漸升高。當海藻酸鈉濃度為2.0%時，相對酶活力最高，但此時機械穩定度為0.83。當海藻酸鈉濃度升高至3.0%，相對酶活力略有降低，為98.34%，但機械穩定度可提高至0.92。綜合考慮，選擇海藻酸鈉的最適濃度為3.0%。

2.1.2 CaCl2濃度對固定化效果的影響

CaCl2濃度對固定化效果的影響見圖2。

圖2 CaCl2濃度對固定化效果的影響Fig.2 Effect of calcium chloride concentration on the immobilization

CaCl2是固定化過程中的一個重要因素。Ca2+通過和海藻酸根離子反應生成不溶于水的海藻酸鈣網狀結構[20]，從而將細菌包埋其中。當CaCl2濃度過低時，兩離子的反應程度低，凝膠交聯度差，制備過程中菌體流失嚴重；當CaCl2濃度過高時，固定化細胞致密性高、通透性差，不利于物質交換，不利于酶活力的發揮。由圖2可知，當CaCl2濃度為3.0%時，相對酶活力最高。綜合考慮，選擇CaCl2的最適濃度為3.0%。

2.1.3 固定化細胞平均粒徑對固定化效果的影響

平均粒徑對固定化效果的影響見圖3。

圖3 平均粒徑對固定化效果的影響Fig.3 Effect of average particle size on the immobilization

由圖3可知，平均粒徑小于3.2 mm時，相對酶活力隨著平均粒徑的增大而提高，可能是由于固定化細胞的平均粒徑越小，機械穩定度越低，制備過程造成的菌體流失越嚴重，因此適當增加粒徑大小可提高相對酶活力；當平均粒徑大于3.2 mm時，隨著粒徑的增大，相對酶活力反而降低，這可能是由于顆粒越大，球狀體的比表面積越小，固定化細胞與外界進行物質交換的總面積越小，且粒徑越大的固定化細胞在催化體系內的流動性越低，因而催化效率越差。因此，選擇3.2 mm為固定化細胞制備的最適粒徑。

2.1.4 硬化時間對固定化效果的影響

硬化時間對固定化效果的影響見圖4。

圖4 硬化時間對固定化效果的影響Fig.4 Effect of solidifying time on immobilization

由圖4可知，當硬化時間為4 h時，相對酶活力最高。這可能是由于較短的硬化時間導致海藻酸鈉與CaCl2交聯程度不夠，導致機械穩定度不高，固定化細胞在收集沖洗過程中造成了菌體的流失；而較長的硬化時間導致海藻酸鈉與CaCl2的交聯程度過高，形成了致密的空間網狀結構，增加了底物擴散的阻力。因此，選擇硬化的最佳時間為4 h。

2.1.5 固定化細胞條件的優化

以比酶活力為考察指標，通過正交試驗進一步優化細胞固定化條件，正交試驗結果分析見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可知，對固定化細胞比酶活力影響最大的因素是海藻酸鈉濃度，其次是硬化時間、平均粒徑、CaCl2濃度，最佳固定化條件為海藻酸鈉濃度2.5%、CaCl2濃度3.0%、平均粒徑3.2 mm、硬化時間4 h。與正交試驗結果一致。

2.2 固定化細胞的酶學性質和操作穩定性

2.2.1 固定化細胞的最適反應pH值

在pH值為3.0～7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖體系中測定固定化細胞和游離細胞的酶活力，結果見圖5。

圖5 pH值對固定化細胞和游離細胞酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity of immobilized cells and free cells

如圖5所示，細胞固定化后最適反應pH值沒有變化，依然為4.5。

2.2.2 固定化細胞的最適反應溫度

在25℃～40℃測定固定化細胞和游離細胞的酶活力，結果見圖6。

圖6 溫度對固定化細胞和游離細胞酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity of immobilized cells and free cells

如圖6所示，細胞固定化后最適反應溫度沒有變化，依然為35℃。

2.2.3 固定化細胞的操作穩定性

固定化細胞循環利用結果如圖7所示。

圖7 固定化細胞的操作穩定性Fig.7 The operation stability of immobilized cells

從圖7可以看出，固定化細胞的相對酶活力下降趨勢較為緩慢。固定化細胞在重復利用第2次時，相對酶活力為初始值的91.4%，繼續重復利用至第7次后仍保持53.2%的相對酶活力，顯示出良好的操作穩定性。

3 結論

本研究以海藻酸鈉為載體，采用包埋法對短乳桿菌細胞進行了固定化，確定最優固定化條件為海藻酸鈉濃度2.5%、CaCl2濃度3.0%、小球平均粒徑3.2 mm、硬化時間4 h。該固定化細胞最適pH值為4.5，最適溫度為35℃，與游離細胞相比均未改變，且表現出較好的操作穩定性，重復利用至第7次后仍保持53.2%的相對酶活力。